دانشکده علوم
گروه زيست شناسي
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد گرايش اکولوژي تاکسونومي
بررسي تنوع ژنتيکي جمعيتهاي بلوط ايراني(Lindl. Quercus brantii) در بخشي از منطقه زاگرس با استفاده از مارکر مولکولي SRAP
پژوهش و نگارش:
ستاره بنيطالبي دهکردي
اساتيد راهنما:
دکتر فاطمه رحماني
دکتر محمد حسن جعفري صيادي
بهمن ماه 1391
حق چاپ و نشر مطالب اين پايان نامه براي دانشگاه اروميه محفوظ است
تقديم به
پدر و مادر عزيزم
که در لحظهلحظهي زندگيم عاشقانه چشمهي جوشان محبتشان را به پاي ريشهي وجودم نثار ساختند و سايبان وجودشان را بر آرامش روحم گستراندند.
بر دستانشان بوسه ميزنم و به افتخار حضوري که بر تارک نامم داشتند بر خود ميبالم .
حمد و سپاس بيکران خالق پاکي را سزد که تکريم و سپاس به يمن عظمت خلقت او شايستگي يافت، قدرت لايزالي که عالم َبه وجوب سجده بر او ،جبه بر خاک مي سايند و نغمه ي ذکر او بر زبان رانند.
بارخدايا!
چگونه ستايمت، که برتر از توان ستايش حقيري چون مني!
و چگونه سنايت را گويم، که تو برتري از هرآنچه بر دل و زبان آرم!
قصور زبانم را به عظمت خود ببخش! و از ناتواني وجودم به اقتدار بيمثالت درگذر! اي حي دانا !که تو خود واقفي بر حقارت مخلوقت ! در ذکر نهايت کرم وجود تو بر بندگانت همين بس ،که با دميدن بر روح انسان تمام صفات شايسته خود را با او همراه ساختي،
تا چنانچه بهسبب قدرت اختيار، نفس سرکش را لگد کوب نمايد وجودش زيبنده صفات بيبديل تو شود
اي بخشنده، اي عالم، اي توانا، اي صمد، اي ستارالعيوب و اي مدبّر و …
زان گه که تو را بر من مسکين نظر است آثارم از آفتاب مشهورتر است
گر خود همه عيبها بدين بنده در است هر عيب که سلطان بپسندد هنر است
سپاس، که در هر لحظهي زندگي تو را در کنار خود يافتم و درکشاکش دهر، در پناه تو آرميدم. و سپاس از تمام لطف و کرمي که هرگز از من مضايقه نفرمودي. اينک که در خوشهچيني از دشت کرمت رهآوردي را به قضاوت اساتيد بزرگوار نهادهام. اميد دارم در اين مرحله نيز با افتخار تاج بندگي چون تويي را مانند هميشه بر سر نهم و طالب علمي شوم آنچنان که لايق بنده توست.
آمين يا رب العالمين
با تشکر ويژه از اساتيد گرامي سرکار خانم دکتر فاطمه رحماني وجناب آقاي دکتر محمدحسن جعفري صيادي
و اساتيد داور جناب آقاي پروفسور کاراپتيان و جناب آقاي دکتر حسيني
هماتاقيهاي عزيزم و همه دوستان و عزيزاني که در اين مسير خالصانه از هيچ راهنمايي و هدايتي درحق اينجانب مضايقه نفرمودند.
وهمچنين تشکر از مسئولين دانشگاه اروميه و پژوهشکده زيستفناوري وکليه اساتيد و داوران بزرگواري که با نگاه کاوشگرانه و قضاوت عالمانه خود جويندگان و طالبان علم را، هدايت نموده و برايجاد خودباوري و توانمندي جوانان ايراني همت گماردهاند.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: کليات
مقدمه و هدف2
گياهشناسي تيره راش Fagaceae3
شرح تاکسونوميک جنس بلوط Quercus4
1-3-1 خصوصيات تاکسونوميک گونه Quercus brantii5
پراکندگي جهاني اين جنس 6
پراکندگي اين جنس در ايران7
شرايط اکولوژيکي8
ترکيبات شيميايي بلوط 8
اهميت درماني بلوط8
مصرف خوراکي بلوط10
اهميت اقتصادي بلوط10
تنوع ژنتيکي11
1-11-1- اهميت تنوع ژنتيکي و روشهاي مختلف ارزيابي آن12
انواع نشانگرها12
1-12-1- نشانگرهاي مورفولوژيکي13
1-12-2- نشانگرهاي بيوشيميايي13
1-12-3- نشانگرهاي مولکولي مبتني بر DNA 14
1-12-3-1- نشانگرهاي غير مبتني برPCR 15
1-12-3-2- نشانگرهاي مبتني برPCR 16
1-12-3-2-1 نشانگرPAPD 17
1-12-3-2-2 نشانگرAFLP 17
1-12-3-2-3 نشانگرSSR 17
1-12-3-2-4 نشانگرISSR 18
1-12-3-2-5 نشانگرSRAP و مزايا و معايب آن19
کاربرد نشانگر(مارکر)هايDNA 20
واکنش زنجيرهاي پليمراز(PCR)21
1-14-1- مراحل واکنش زنجيرهاي پليمراز22
تجزيه و تحليل دادهها24
1-15-1 دندروگرام24
1-15-2 تجزيه خوشه اي25
1-15-3 ضريب شباهت26
1-15-4 انتخاب الگوريتم26
بررسي كارآيي الگوريتم مورد استفاده در تجزيه كلاستر26
شاخص شانون27
بررسي تنوع و تفاوت ژنتيکي بين جمعيتها براساس آناليز Nei27
سابقه تحقيق28
1-15-1- مروري بر برخي پژوهشهاي انجام شده بر روي Quercus brantii Lindl.28
1-15-2- مروري بر برخي پژوهشهاي انجام شده با استفاده از نشانگرSRAP28
فصل دوم: مواد و روشها
2-1- انتخاب مناطق و جمعيتها33
2-2- جمعآوري نمونه ها و آماده سازي آنها34
2-3- استخراج DNA از نمونه هاي گياهي34
2-3-1- آماده کردن نمونه ها34
2-3-2- استخراج DNA35
2-3-2-1- مواد موردنياز35
2-3-2-2- روش کار36
2-4- تعيين كيفيت وكميت DNA37
2-5- واكنش زنجيره اي پليمراز) (PCR39
2-6- الکتروفورز41
2-6-1- محلول اتيديوم برومايد42
2-6-2- تهيه ژل الکتروفورز43
2-6-3- الکتروفورز محصول PCR43
2-7- تجزيه و تحليل داده ها44
فصل سوم: نتايج و بحث
3-1پليمورفيسم 46
3-2 بررسي پارامترهاي اصلي تنوع ژنتيکي همه لوکوسها در جمعيتهاي گونهQuercus brantii Lindl. 50
3-3 بررسي تنوع و تفاوت ژنتيکي بين جمعيتها براساس آناليز Nei52
3-4 شباهت و فاصله ژنتيکي بين 5 جمعيت54
3-5 بحث و نتيجهگيري کلي55
3-6 پيشنهادات59
منابع62
فهرست شکلها
شکل1- 1 پراکندگي جهاني جنس بلوط (Quercus)6
شکل 1-2 پراکندگي جنس بلوط(Quercus) در ايران7
شکل 1-3 نمايي از گونه Quercus brantii Lindl.10
شکل 1-4 نحوه اتصال پرايمرهاي forward و reverse به DNA الگو20
شکل 1-5 واکنش زنجيرهاي پليمراز24
شکل2- 1 جمعيتها و مناطق بررسي شده در اين تحقيق33
شکل2-2 نمونههاي برگ تازه در آزمايشگاه34
شکل 2-3 دستگاه اسپکتروفتومتر براي تعيين کميت DNA38
شکل 2-4 دستگاه ترموسايکلر41
شکل 2-5 دستگاه الکتروفورز عمودي42
شکل 2-6 ساختار اتيديوم برمايد42
شکل 2-7 دستگاه ژل داک43
شکل 3-1 الگوي باندي پرايمر46
شکل 3-2 دندروگرام ژنوتيپ هاي مورد بررسي55

فهرست جداول:
جدول 2-1 اسامي جمعيتها و مناطق بررسي شده در اين تحقيق33
جدول 2-2 مواد استفاده شده در PCR39
جدول 2-3 برنامهPCR 40
جدول 2-4 پرايمرهاي مورداستفاده در آزمايش40
جدول 3-1 نتايج کدگذاري آغازگر Me2-Em2 براي همهي جمعيتها47
جدول 3-2 نتايج چندشکلي پرايمرهاي استفاده شده در اين تحقيق49
جدول 3-3 پارامترهاي تنوع ژنتيکي همه لوکوسها در کل نمونهها بر اساس مارکر SRAP51
جدول 3-4 شاخصهاي تنوع بين جمعيتي HT، HS، GST و Nem در جمعيتهاي Q. brantii53
جدول 3-5 جدول ماتريس تشابه بدست آمده براي نشانگر SRAP در بين جمعيتها54
چکيده
بلوط (Quercus) يکي از مهمترين جنسهاي چوبي نيمکره شمالي است. اين جنس از اصليترين گونههاي درختي ايران به شمار ميرود. تاکسونومي و ارتباط تکاملي جمعيتهاي بلوط ايراني بر اساس مارکرهاي مولکولي به طور گستردهاي مطالعه نشده است. در اين مطالعه، ارتباط ژنتيکي جمعيتهاي بلوط با به کارگيري مارکر SRAP امتحان شد. پنج جمعيت بلوط از مناطق مختلف زاگرس شامل ياسوج، برمدشت، بيستون، آبدانان و خوزستان جمعآوري و آناليز شدند. يازده جفت پرايمر SRAP در کل نمونهها 32 باند از 100 تا 400bp ايجاد کردند. 27 تا از اين باندها پليمورف بودند و درصد پليمورفيسم38/84% به دست آمد. ضريب تشابه ني محاسبه شد و دندروگرام بر اساس UPGMA از روي دادههاي SRAP ترسيم شد. دادههاي SRAP با به کارگيري نرمافزار popgene در چهار خوشه دستهبندي شد. آناليز ژنتيکي دامنه تشابه ژنتيکي بين جمعيتي نسبتاً بالا از حداقل 8818/0 بين ياسوج و برمدشت تا حداکثر 9587/0 بين بيستون و آبدانان را نشان داد. جمعيتهاي مطالعه شده بلوط تنوع بالايي را نشان دادند: شمار آلل موثر 46/1 بود و شاخص تنوع ژنتيکي شانون (I) به طور متوسط 69/41% بود. جمعيتهاي امتحان شده اختلاف ژنتيکي بين جمعيتي نسبتاً بالايي را (2/0 GST=) نشان دادند و جريان ژني(Nem) 96/1 بود.
واژههاي کليدي: بلوط، تنوع ژنتيکي، مارکر مولکولي SRAP، ني، پليمورفيسم
فصل اول:
کليات
1-1 مقدمه و هدف
بلوط (Quercus) از تيره راش (Fagaceae) يکي از متنوعترين جنسهاي درختان نواحي معتدل با بيش از 500 گونه در سراسر جهان است(61). بلوط جزء گياهان پهن برگ است و اساساً اين جنس بومي نيمکره شمالي ميباشد و شامل گونههاي خزانپذير و هميشهسبز ميباشد که در عرضهاي جغرافيايي مختلف آسيا و آمريکا گسترده شدهاست (15). از زمان داروين بلوط به عنوان يک جنس مدل براي مطالعه فرآيندهاي تکاملي و گونهزايي به کار ميرود، سازگاري بالا و مراحل مختلفي از جريان ژني بين گونهاي به طور معنيداري در پيدايش صدها گونه و زيرگونه و اکوتيپهاي متعدد مشارکت داشتهاست(21). از يک طرف اين انعطافپذيري فنوتيپي و تنوع ژني باعث موفقيت اين جنس در گونهزايي شدهاست و از طرف ديگر اين خاصيت مشکلاتي را در تخمين تنوع ژنتيکي بين گونهها و ساختار ژنتيکي جمعيتها و ارتباط تاکسونوميکي بين گونهها ايجاد کردهاست که بايد به طريقي اين مشکل رفع شود(30). يکي از علل عمده اين تنوع ژنتيکي در بلوط فراواني تبادل ژني و دخول بين گونههاي جنس بلوط هيبريداسيون ميباشد(24).
در حال حاضر با فشار ناشي از تخريب و بهرهبرداري از جنگلها توسط انسان، تغييرات اقليم و پديده گرم شدن کره زمين پيشبيني ميشود، طي 50 تا 100 سال آينده جمعيت بسياري از گونههاي گياهي در رويشگاههاي کنوني ضعيف و ضعيفتر شده (3) و آينده جنگلهاي بلوط را با مخاطرات جدي مواجه سازد. همچنين وجود مشکلاتي نظير کمبود درختان مادري، تناوب سال بذردهي، آفات و امراض، توليد دانه ناکافي و نامناسب، ضعف دانهزادي و عدم نگهداري دانهها براي مدت طولاني (63)، روند احياء طبيعي جنگلها را از طريق بذر با مشکل روبرو کردهاست. تدوين برنامه حفاظت از منابع ژنتيکي بلوط و توسعه و احياء جنگلهاي آن از طريق بذرکاري و نهالکاري ميتواند از جمله مهمترين و اصوليترين اقدامات احيايي و حفاظتي رويشگاههاي اين جنس باشد. بطورکلي گزارشات موجود نشان ميدهد که در بسياري از موارد به دليل ناسازگاري ژنتيکي نهالهاي کاشته شده با شرايط محيطي(15)، نرخ پايين زندهماني آنها(51)، بايد توسط بذر ژنوتيپهايي جنگلکاري شود که با شرايط اقليمي دورههاي آينده سازگاري داشته باشد. با اين وجود تنظيم و اجراي برنامههاي حفاظت از منابع ژنتيکي و جنگلکاري با بذر ژنوتيپهاي سازگار با استرسهاي احتمالي نيازمند کسب اطلاع از تنوع ژنتيکي بين و درون جمعيتها است(53).
علاوه بر اهميت اکولوژيکي بلوط، اين جنس داراي مصارف دارويي، خوراکي و صنعتي فراوان نيز ميباشد(28). اين جنس يکي از مهمترين گياهان چوبي تشکيلدهنده جنگلهاي بلوط غرب محسوب ميشود ولي به دليل دور شدن اين جنگلها از حالت کليماکس و کاهش قابل توجه گونههاي جنگلي تعيين تنوع ژنتيکي و حفاظت ذخاير آنها ضروري به نظر ميرسد(23).
مطالعات قبلي مدارک فراواني را مبني بر تنوع بينگونهاي براساس کاراکترهاي فنوتيپي فراهم کردهاند تنوع در اين جنس براساس ويژگيهاي بيولوژيک، مورفولوژيک و فنولوژيک شناسايي و شرح داده شده است، به خصوص مورفولوژي برگ در اين مورد مفيد است و ساختار جمعيت بلوطها بر اساس ويژگي مورفولوژيکي برگ مطالعه شده است (61 و 21). تاکنون مطالعه روي تنوع ژنتيکي درون گونهاي بلوط ايراني در مناطق مختلف ايران با استفاده از مارکر SRAP صورت نگرفته است.
مارکرهاي مولکولي مهمترين و کاربرديترين سيستمهاي مارکري هستند که گستردگي زيادي داشته و هر روزه در حال توسعه و تکامل هستند، و از آنجا که در اولين سطح از بيان ژن مطرح مي شوند خيلي دقيق بوده و داراي تنوع زياد و پلي مورفيسم بالا هستند (15). در بين نشانگرهاي مولکولي ريزماهوارهها به دليل توانمنديهاي ويژهاي که در شناسايي تنوع ژنتيکي ارقام و گونههاي مختلف درختان دارند از کارايي بالايي برخوردارند. هدف از کار حاضر ارزيابي امکان بکارگيري مارکر SRAP در مطالعات ژنتيکي درونگونهاي بلوط و مطالعات ژنتيک جمعيت و سنجش تنوع ژنتيکي در جمعيتهاي مختلف اين گونه و تخمين ساختار ژنتيکي و اختلاف بين جمعيتها در قسمتهاي مختلف قلمرو آن در جنگلهاي زاگرس است که اميد ميرود کمکي در جهت طبقهبندي اين جنس و بهنژادي اين گياه در آينده باشد.
1-2 گياهشناسي تيره راش (Fagaceae)
تيره راش (بلوط يا پيالهداران) در جهان داراي 6 جنس و حدود 600 گونه است. درختان يا درختچههايي يکپايه، خزانکننده يا هميشهسبز هستند. برگها متناوب، ساده، کامل، دندانهدار، کنگرهدار يا داراي لوبهاي شانهاي، دمبرگدار گوشوارکدار که زودافت و در برخي پايا هستند. گلها يکجنسي و در سنبلههاي دمگربه اي مجتمعاند. گلهاي نر داراي کاسهاي کوچک با تعدادي پرچم و گلهاي ماده داراي کاسهاي کوچک چسبيده به 3 تا 6 برچه با تمکن محوري و تخمدان زيرين و داراي خامه و کلالههاي آزاد هستند. در کنار هر برگک سنبلهي ماده معمولا گلآذين گرزني شامل 3 گل وجود دارد که گاهي فقط يک گل از آن به رشد خود ادامه ميدهد. گلهاي ماده را اندامي پيالهاي شکل حاصل از تراکم برگکهاي فلس مانند محصور ميکند که همراه با رشد فندقهها رشد ميکند و نقش حفاظت فندقه را بر عهده ميگيرد. در هر گل فقط يک برچه ميتواند به رشد خود ادامه دهد و به يک فندقه تبديل شود. گاهي گياهشناسان گياهان اين تيره را به دليل داشتن کاسه گل پيالهمانند، که به خصوص در بلوط و شاهبلوط قابل توجه است، پيالهداران نيز ميگويند (10و8).
1-3 شرح تاکسونوميک جنس بلوط Quercus
بلوط يکي از متنوعترين جنسها از درختان نواحي معتدل است که بر اساس گفتهي محققان شمار گونههاي بلوط بين 300 تا 600 متفاوت است (61). در اين جنس سنبله نر به شکل شاتون آويخته و محور آن داراي گلهاي منفردي با پوششي متشکل از پنج قطعه در قاعده است که به هم متصل شده و داراي 5 يا تعدادي پرچم است. سنبله ماده معمولاً کمگل است و غالباً فقط به يک گل يا دو گل ختم ميشود. بخش پايين هر گل را اجتماعي از فلسها به صورت پياله محصور ميسازد. گلپوش داراي 6 قطعه واقع در دو حلقه است. مادگي زيرين و داراي دو تخمک واژگون بوده و خامه به کلاله سهبخشي منتهي است. ميوه بصورت فندقه بزرگي با برونبر چرمي است که قاعدهي آن درون پيالهاي مقاوم قرار دارد. مادگي در جريان رشد تمام تخمکهاي خود را از دست داده و فقط يکي از آنها به رشد خود ادامه ميدهد، بنابراين ميوه بلوط يک فندقهاي است. بيشتر گونههاي بلوط درختان بلند جنگلي با تنههاي ضخيم و چوبي سخت و مقاوم هستند. بلوطها گاهي بيشتر از 200 سال عمر ميکنند (8). بسياري از گونههاي بلوط داراي هر دو نوع توليد مثل جنسي و غيرجنسي هستند. توليد مثل جنسي از طريق توليد دانه و توليد مثل غيرجنسي از طريق پاجوشهاي ريشه صورت ميگيرد و افراد حاصل در پاسخ به فاکتورهاي اکولوژيکي و ژنتيکي متنوع ميشوند (14). ردهبندي بلوط بر اساس ردهبندي کرانکوئيست به صورت زير ميباشد:
Kingdom: Plantae
Division: Magnoliophyta
Class: Magnolipsida
Order: Fagales
Family: Fagaceae
Sub Family: Quercoideae
Genus: Quercus
1-3-1 خصوصيات تاکسونوميک گونه Lindl. Quercus brantii
درختي است که هيچگاه مرتفع نيست (شکل1-3)، حداکثر به ارتفاع 10 متر، با پوست خاکستري، شياردار، شاخههاي جوان با کرکهاي زرد نمدي يا نمدي خاکستري شونده، جوانهها تخممرغي به طول 2 تا 5 ميليمتر با فلسهاي درشت، کرکدار. برگها در زمستان ريزان، در روي سطح فوقاني با کرکهاي ستارهاي تنک، سطح تحتاني با کرکهاي ستارهاي زرد يا خاکستريشونده گاهي مخلوط با کرکهاي غدهدار پتويي؛ پهنک به طول 6-10 (15-) و عرض 4-7 (9-) سانتيمتر، تخممرغي يا مستطيلي تخم مرغي، با قاعده قلبي، دندانههاي 7 تا 14 تايي کوتاه با نوکي به طول 1-2 ميليمتر؛ رگبرگهاي فرعي 8-16 جفت، موازي، تا ميان دندانهها ممتد (در ميان دندانهها نفوذ مي کند)؛ رگبرگهاي بينابيني (فرعيتر) وجود ندارد؛ دمبرگ به طول 1-2 سانتيمتر. گل آذين دمگربهاي نر به طول 4-6 سانتيمتر، با محور کرکدار؛ گلپوشهاي نر با بريدگيهاي پهن 4-6 تايي کمعمق (هيچگاه بريدگيها عميق نيستند)، بريدگيها به نيمه گلپوش نميرسند؛ پرچمها 5-7 تايي. گلهاي ماده منفرد يا دوتايي، با محوري به طول 15 سانتيمتر. پياله نيمهکروي يا مخروطي که 20 تا 50 درصد ميوه را در بر ميگيرد، به ارتفاع 2-3 سانتيمتر وقطر 4 سانتيمتر، با فلسهاي درشت، کرکدار، به صورت افقي گسترده. ميوه بلوط به طول تا 5 سانتيمتر، با زخم محدب. اين گونه اغلب گال ايجاد ميکند(11).
-4 پراکندگي جهاني اين جنس
اين جنس بومي نيمکره شمالي (اروپا، افريقا، آمريکاي شمالي و آسيا مخصوصا در جزاير پلينزي در اقيانوس آرام) است (14) و از نواحي قطبي تا نواحي نيمهخشک پراکنده شدهاست (16). مکزيک يکي از مراکز تنوع جنس بلوط است که داراي 135 تا 150 گونه شامل 86 گونه اندميک ميباشد (61)(شکل1-1).
شکل1- 1 پراکندگي جهاني جنس بلوط (Quercus)
1-5 پراکندگي اين جنس در ايران
در ايران نيز چند گونه بلوط در جنگلهاي شمال و غرب ايران انتشار دارند Q. macranthera با نام محلي اوري و Q.castanefolio با نام محلي مازو از مهمترين جنگلهاي شمال و ارسباران هستند (5). جنگلهاي زاگرس که جنگلهاي بلوط غرب نيز ناميده مي شود با طول تقريبي 1300 کيلومتر در امتداد رشتهکوه زاگرس از جنوب آذربايجان غربي تا استان فارس ادامه دارند (21 و 14). درخت بلوط از بارزترين گياهان درختي به شمار ميرود (21). زاگرس جنوبي رويشگاه خالص گونه Q.brantii Lindl. يا بلوط ايراني ميباشد(شکل1-2).
شکل 1- 2 پراکندگي جنس بلوط(Quercus) در ايران
1-6 شرايط اکولوژيکي
درخت بلوط در خاک پررس مرطوب رشد ميکند ولي خاکهاي شني را نيز تحمل ميکند. اين درخت در مناطق جنگلي و پست يافت ميشود. جنگلهاي بلوط به دوره کوتاه خشکي در تابستان و باران زياد در بهار نياز دارند (2).
1-7 ترکيبات شيميايي بلوط
در پوست و برگ درختان بلوط تاننهايي وجود دارد که از نظر ترکيب شيميايي مشابهت نزديک با يکديگر دارند. پوست شاخههاي جوان برخي گونههاي دارويي داراي 10 تا 20 درصد (در شاخههاي مسن 0 تا 10 درصد) از نوعي تانن فيزيولوژيکي يعني اسيد کوئرسيتانيک1 محلول در آب، نوعي قند محلول در آب به نام کوئرسيت2، 6/1 درصد اسيد گاليک، اسيد ماليک، يک ماده تلخ به نام کوئرسين3 ، فلوروگلوسين، موسيلاژ، مواد پکتيکي، مواد رزيني، اکسالات کلسيم و نوعي ماده رنگي قرمز به نام قرمز بلوط و به مقدار کم از کولاکاتشين4 و غيره است. ميوه داراي 5 درصد ماده روغني، 65/6 درصد پروتئين، 7 درصد از قندهاي مختلف، 3/44 درصد آميدون، 2/3 درصد پنتوزان، مقدار کمي کوئرسيت و معادل 7 درصد از نوعي تانن است. در گال که بر روي برگ و جوانههاي بلوط تحت اثر گزش حشرات مخصوص از دسته نيمبالان، ايجاد ميشود نوعي تانن به نام اسيد گالوتانيک5 يافت ميشود که سابقا آن را انيدريدي از اسيد گاليک تصور مينمودند و در نتيجه آن را اسيدديگاليک6 نوعي گلوکوزيد تصور ميکردند (4).
1-8 اهميت درماني بلوط
اهميت درماني درختان بلوط بيشتر مربوط به تانني است که در اندامهاي آن فراهم ميشود. اين ماده را بايد يکي از شاخصترين موادي دانست که در عالم گياهان توليد ميشود. اين ماده مهم گياهي خواص مختلفي نظير رسوب دادن آلبومين، به وجود آوردن پوشش محافظ براي بافتها، جلوگيري کردن از عفونيشدن و غيره را داراست. طبق بررسيهايي که به عمل آمده است فراوردههاي تانن تاثير مثبتي در درمان سل، التيام زخمها و جلوگيري از ترشحات مخاط دارند. اعضاي مختلف درختان بلوط به علت دارا بودن تانن اثر قابض، بند آوردن خون و تقويتکننده عمل بعضي از اعضاي بدن را دارند. برگ بلوط در بيماريهاي مختلف مانند اختلاط خوني، خونرويهاي مختلف، زخم معده، آغاز بيماري سل، ديسانتري، بياختياري دفع ادرار در اطفال، رفع ترشحات زنانگي و بواسير اثر قاطع دارد. در استعمال خارجي، جوشاندههاي غليظ آن به صورت غرغره در معالجه ورم حنجره و لوزه مؤثر واقع ميشود.
پوست درخت بلوط (Q. robur) پادزهر خوبي در مسموميتهاي ناشي از آلکالوئيدها است و اثر غيرقابلانکاري در رفع خونرويها، اختلاط خوني، سل، نرمي استخوان و غيره دارد (پوست گونههاي ديگر به علت دارا بودن تانن فراوانتر کمتر در مصارف داخلي بکار ميروند). بايد توجه داشت مصرف زياد يا طولاني مدت آن باعث خستگي عضلات معده، احساس درد عضله قلب و تحريک دستگاه هضم ميشود. ارزش درماني پوست بلوط در استعمال خارج، بيشتر از مصارف داخلي آن است مانند آن که استعمال جوشاندههاي گرد پوست بلوط، به صورت حمامهاي موضعي، لوسيون، غرغره، تنقيه و شستشو به صورتهاي مختلف، جهت درمان بيماريها در موارد اولسرهاي سرطاني، التهاب غدد به علت انسداد مجاري آنها، خونمردگي سوداء، بيماريهاي مزمن پوستي ديگر، اگزما، واريس، خيز عمومي بدن و غيره ميتوان استفاده کرد. از لوسين موجود در پوست درخت بلوط، در موارد انسداد مجاري لنفاوي، دررفتگي اعضا، جمع شدن آب در مفاصل، سرمازدگي، اولسرهاي عفوني و اولسرهاي قانقاريايي چرکين نيز استفاده ميشدهاست، به علاوه آن را در موارد بروز ترشحات مهبلي و سوزاکهاي مزمن و غيره هم بکار ميبردهاند.
ميوه بلوط جهت رفع اسهال و درمان ديسانتري، سوءهاضمه، درد معده، نزلههاي مزمن، کمخوني، نرمي استخوان، سياهسرفه، درمان سل در مراحل اوليه، سستي و ضعف استخوانها و غيره به کار ميرود. مخلوط آرد ميوه بلوط بوداده با کاکائو، بهترين دارو جهت رفع اسهالهاي ساده اطفال است.
گالها به عنوان مقوي معده، قابض و رفعکننده خونرويها به کار ميروند (4).
1-9 مصرف خوراکي بلوط
ميوه فندقه درختان بلوط که عموماً در پيالهاي جاي دارد و آکورن ناميده مي شود، از قديم مورد استفاده مردم دنيا بودهاست. طعم آن در بعضي گونهها مانند Q. ballota Desf مخصوصاً نژادي از آن که در الجزيره و اسپانيا ميرويد بسيار مطبوع است. بعضي از گونههاي آمريکا و برخي از انواع موجود در ايران نيز ميوههاي خوراکي دارد و از آنها براي تغذيه استفاده ميشود. از مخلوط آرد ميوه درشت بلوط با آرد گندم، در بعضي نواحي نان تهيه ميشود. در دورانهاي قبل ميوه بلوط را بو ميدادند تا تانن آن با اين عمل کاهش يابد سپس از آن در تهيه نوعي قهوه استفاده ميکردند، اين قهوه داراي دکسترين به جاي آميدون ميوه است (4). ميوه بلوط هم به صورت مستقيم مورد تغذيه دام و وحوش قرار ميگيرد و هم جمعآوري شده و به عنوان علوفه زمستاني مورد تغذيه دام قرار ميگيرد (2).
1-10 اهميت اقتصادي بلوط
درخت بلوط از مهمترين درختان جنگلي ايران محسوب ميشود. چوب آن داراي مصارف صنعتي است. چوب بلوط داراي چگالي g/cm375/0 بوده و استحکام و سختي زيادي دارد و نسبت به حشرات و حمله قارچها بسيار مقاوم است و بافت بسيار جالبي دارد. پوست و گالهاي درخت بلوط هم سرشار از تانن هستند و در صنعت چرمسازي و رنگسازي مورداستفاده قرار ميگيرد (5).
شکل 1-3 نمايي از گونه Quercus brantii Lindl.
1-11 تنوع ژنتيکي :
تنوع ژنتيکي به تنوع ژني درون گونهها اطلاق ميشود. به عبارتي تنوع ژنتيکي، تنوع قابل توارث درون و بين جمعيتهاست. کليه تنوعهاي موجود با توالي چهار جفت باز تشکيلدهنده مولکول DNA، اجزا سازنده کدهاي ژنتيکي مرتبط ميباشند. انواع ديگري از تنوع ژنتيکي را نيز ميتوان در کليه سطوح سازماندهي شده در هسته شامل مقدار DNA، تعداد کروموزم و ساختار DNA شناسايي کرد. تنوع و تکامل ژنتيکي در جمعيتهاي گياهي ميتواند بوسيله جهش، نوترکيبي، مهاجرت، رانده شدن ژنتيکي و گزينش ژنتيکي ايجاد شده باشد (64). کسب اطلاع از فاصله ژنتيکي در بين افراد يا جمعيتها و آگاهي از روابط خويشاوندي گونههاي موردنظر در برنامههاي اصلاحي، امکان سازماندهي ژرمپلاسم و نمونهگيري مؤثر از ژنوتيپها را فراهم ميسازد (1). قدم اول در اصلاح خصوصيات گياهي، فهم از ساختار کلکسيون ژرمپلاسم است که اين موضوع به نوبه خود نمونهگيري سيستماتيک ژرمپلاسم را براي مقاصد اصلاحي و حفاظتي امکانپذير ميسازد. براي بهرهبرداري از منابع ژنتيکي با حداکثر کارآيي، شناخت مواد ژنتيکي نگهداري شده ضرورت دارد. ارزيابي نمونهها ميتواند با توجه به هدف استفاده از ژرمپلاسم صورت گيرد که جنبههاي اگرونوميکي، پاتولوژيکي، مورفولوژيکي، سيتولوژيکي، بيوشيميايي و مولکولي از جمله اين اهداف است. در راستاي اين ارزيابي نقاط قوت و ضعف تودهها و ژنوتيپها و پتانسيلهاي موجود در آنها شناخته ميشود. به عبارت ديگر در اين ارزيابيها وسعت پايه ژنتيکي هر صفت معلوم ميگردد (12 ،7 و6) تنوع ژنتيکي يک صفت معين، اندازه پراکنش ارزشهاي همان صفت است، به طوري که تأثير محيط بر آن زدوده شده باشد. تنوع بين گياهان يک گونه گياهي خاص بر دو نوع است: تنوع بر اثر محيط، که به مقادير مختلف تنش محيطي واکنش ميدهد و با مقايس? گياهان دو جمعيتي که از لحاظ ژنتيکي يکنواخت هستند، ميتوان آنرا مشاهده نمود. تأثير محيط روي يک گياه، به نتاج آن منتقل نميشود و بنابراين انتخاب در يک جامعه يکنواخت ژنتيکي، به جدا نمودن نژادهايي که در واکنش به تنشهاي محيطي اختلاف دارند، نميانجامد. تنوع ارثي به تنوع موجود در يک جمعيت مخلوط ژنتيکي، که از عوامل ارثي ناشي شده و به نتاج انتقال مييابد، اطلاق ميگردد .از آنجايي که اين نوع تنوع، ناشي از عوامل ارثي است و به نتاج قابليت انتقال دارد، لذا در اصلاح نباتات و برنامههاي اصلاحي حائز اهميت است، منشأ تنوع ارثي در گياهان، نوترکيبيهاي ژنتيکي، تغييرات درکروموزومها و جهشها است (7).
1-11-1 اهميت تنوع ژنتيکي و روشهاي مختلف ارزيابي آن
شناخت کيفي و کمي تنوع ژنتيکي از اهميت زيادي در علوم بيولوژي مانند اکولوژي، بيولوژي تکامل، تاکسونومي يا ردهبندي، ژنتيک و اصلاح نباتات برخوردار است. اهميت تنوع ژنتيکي به خوبي براي همه روشن بوده و نشان داده شده است که کاهش تنوع ژنتيکي ميتواند منجر به کاهش شايستگي و سازگاري به تغييرات محيطي گردد. ارزيابي تنوع ژنتيكي معمولاً در سطح مولكولي و با استفاده از چندين روش آزمايشگاهي انجام مي‌گيرد كه از آن ميان مي‌توان به آللوزايمها7 ، آناليز DNA8 و ايزوزيم9ها اشاره كرد كه قادرند ارزيابي دقيقي از تنوع ژنتيكي را فراهم نمايند. ارزيابي ترکيب ژنتيکي گياهان زراعي و مجموعههاي ژنتيکي و قرابت بين آنها از گذشتههاي دور معمول بوده است، بطور تاريخي اين تخمين براساس بيولوژي اندامهاي جنسي، دادههاي اکوجغرافيايي، زيستشناسي، رنگيزهها و شجرهنامه و اخيراً با استفاده از نشانگرهاي پروتئيني مانند ايزوزايم صورت ميگرفته است همچنين تنوع ژنتيكي ممكن است با استفاده از صفات مورفولوژيكي نيز مورد ارزيابي قرار گيرد. بررسي صفات مورفولوژيكي به تكنولوژي گراني نياز ندارد ولي اغلب، اين فعاليتها به زمين وسيعي نياز دارند که اين امر مي‌تواند سبب شود كه اين روش نسبت به روش‌هاي مولكولي هزينه بيشتري داشته باشد. بعلاوه اين صفات اغلب تحت تأثير نوسانات محيطي قرار مي‌گيرند كه موجب مي‌شود ارزيابي تنوع تحت تأثير محيط باشد. با بررسي مجموعههاي ژنتيکي با استفاده از نشانگرهاي مولکولي مبتني بر DNA، تفاوتهاي ژنتيکي بيشتري مشاهده شده، اين تفاوتها تحت تأثير محيط و اثراتي مانند پليوتروپي، اپيستازي و دوره رشدي گياه نخواهند بود و امکان آگاهي دقيق و کافي از تنوع ژنتيکي در سطح DNA را فراهم ميسازند. با توجه به اهميت روزافزون توليد واريتههاي برتر و نياز به شناسايي و استفاده از آللها و ژنهايي که صفات مطلوبي را کنترل مينمايند، استفاده از نشانگرهاي DNA روزافزون خواهد بود.
1-12 انواع نشانگرها:
مارکرها انواع مختلفي دارند. در يک تقسيمبندي کلي ميتوان مارکرها را به صورت زير دستهبندي کرد:
1- مارکرهاي مورفولوژيکي يا فنوتيپي
2- مارکرهاي مولکولي
مارکرهاي مولکولي خود به دو دسته تقسيم ميشوند:
1- مارکرهاي بيوشيميايي
2- مارکرهاي DNA
1-12-1 نشانگرهاي مورفولوژيکي
مارکرهاي مورفولوژيکي همانگونه که از نام آنها مشخص است از روي فنوتيپ ارزيابي ميشوند و لذا ارزيابي آنها خيلي ساده است. تعداد اين مارکرها کم است و پليمورفيزم کمي نيز توليد ميکنند. از طرفي در اغلب موارد مارکر فنوتيپي در واقع يک صفت نامطلوب است، مثلا کوتولگي بوته، ابلق بودن برگ ها و … . لذا امروزه از اين نوع مارکرها استفاده نميشود. نشانگرهاي مورفولوژيکي اولين نشانگرهايي بودند که براي ارزيابي تنوع ژنتيکي مورد استفاده قرار گرفتند (20). نشانگرهاي مورفولوژيك كه پيامد جهشهاي قابل رويت در مورفولوژي هستند، شامل دامنه وسيعي از ژن‌هاي كنترلكننده صفات مورفولوژيك ميشوند كه بر ظاهر يا فنوتيپ موجود مبتني بوده و جزو نخستين نشانگرها به شمار ميآيند كه از زمانهاي بسيار دور، يعني زماني كه هنوز محل ژن روي كروموزوم مشخص نشده بود، مورد استفاده قرار ميگرفتند. دلايل عمده محدوديت استفاده از نشانگرهاي مورفولوژيکي عبارتند از: تعداد اين نشانگرها کم بوده، وابسته به سن و مرحله رشدي گياه هستند و غالباً از شرايط محيطي تأثير ميپذيرند و درضمن اساس ژنتيکي بسياري از آنها هنوز مشخص نشده است. در صورتي که هنوز بررسي تنوع ژنتيكي بر اساس صفات مورفولوژيک يک گام اوليه در جهت توصيف و گروهبندي ژرمپلاسمها است (57).
1-12-2 نشانگرهاي بيوشيميايي
نشانگرهاي بيوشيميايي شامل موارد متعددي است. اين نوع مارکرها نيز امروزه کارايي زيادي ندارند چرا که تعداد آنها کم بوده و پليمورفيزم کافي ايجاد نميکنند، ليکن نکته مثبت در آنها همبارز بودن است.
اين گروه را ميتوان به دستههاي زير تقسيم کرد:
الف. مولکولهاي بيوشيميايي کوچک: مثل ترکيبات فنلي، ترکيبات معطر و …
ب. پروتئينهاي ذخيرهاي: مثل گلوتنين و گليادين که در گندم خصوصا در تعيين ارزش نانوايي کاربرد دارد.
ج. آيزوزايمها: اينها در واقع فرمهاي مختلف يک آنزيم هستند که يک واکنش را کاتاليز ميکنند ولي ممکن است سرعت فعاليت آنها متفاوت باشد. اين مارکرها در دهه 80 کاربرد زيادي داشتند. تنکسلي توانست بر اساس آيزوزايمها در گوجه فرنگي اولين نقشه لينکاژي را طراحي نمايد. و معايب آيزوزايم‌ها عبارتند از: تنها تعداد محدودي آيزوزايم براي هر گونه وجود دارد، تعداد سيستم‌هاي آنزيمي چند شکل و قابل دسترس محدود است و مكان‌هاي آنزيمي فقط شامل قسمت محدود و غيرتصادفي از ژنوم هستند (قسمت بيانشونده). بنابراين تنوع مشاهده شده ممكن است بيانگر كل ژنوم نباشد. اگرچه با اين روش مي‌توان تعداد زيادي از نمونه‌ها را بررسي کرد ولي مقايسة نمونه‌ها از گونه‌هاي مختلف، مكان‌هاي ژني و آزمايشگاه‌هاي مختلف مشكل ساز است. بطوريكه اين روش تحت تأثير روش‌هاي استخراج، بافت گياه و مرحلة رشد گياه قرار مي‌گيرد(62و42).
د. آللوزايم‌ها آلل‌هاي متفاوت آنزيم‌ها هستند كه يك ارزيابي از فراواني ژني و ژنوتيپي در درون و بين جمعيت‌ها ارائه مي‌دهند که اين اطلاعات مي‌توانند جهت گروه‌بندي جمعيت‌ها، تنوع ژنتيكي، جريان ژن، ساختار ژنتيكي گونهها، مقايسة ميزان تلاقي‌هاي بين‌گونه‌اي، ساختار جمعيت و واگرايي جمعيت‌ها استفاده شوند (42).
مزيتهاي مهم اين‌گونه نشانگرها عبارتند از: ارزيابي به صورت هم‌بارز و بدون دخالت تأثيرات اپيستازي و پليوتروپي، كاربرد آسان و هزينة پائين.
1-12-3 نشانگرهاي مولكولي مبتني بر DNA
مارکرهاي DNA در واقع مهمترين و کاربرديترين سيستمهاي مارکري هستند که گستردگي زيادي داشته و هرروزه در حال توسعه و تکامل هستند. از آنجا که در اولين سطح بيان ژن مطرح ميشوند، خيلي دقيق بوده، داراي تنوع زياد و پليمورفيزم بالا هستند.
نشانگرهاي مولكولي بر اساس آشكارسازي تفاوت‌ (چندشکلي10) موجود در بين اسيدهاي نوكلئيك افراد مختلف عمل مي‌كنند. اين تفاوت‌ها شامل پديده‌هاي حذف، اضافه، جابجايي، دو برابر شدن و جهش‌هاي نقطه‌اي است و تنها ژن‌هاي خاص و فعال را شامل نمي‌شود. نشانگرهاي مولكولي علاوه بر اينكه تحت تأثير محيط نيستند داراي مزيت‌هاي زير ميباشند:
1- تمام قسمت‌هاي ژنوم را پوشش مي‌دهند (اگزون‌ها، اينترون‌ها و نواحي تنظيمكننده).
2- تحت تأثير پليوتروپي و اپيستازي قرار نمي‌گيرند.
3- قادر به شناسايي تفاوت‌هايي هستند كه تنوع فنوتيپي نشان نمي‌دهند.
4- بعضي از آنها هم‌بارز هستند.
روش‌هاي مختلف مورد استفاده شامل: هضم و هيبريداسيون اسيدهاي نوکلئيک، روشهاي مبتني بر واكنش‌هاي زنجيره‌اي پليمراز (11PCR) و يا تركيبي از دو روش ذكرشده هستند. بعلاوه روش‌هاي مختلف نشانگري مي‌توانند يك مكان يا چند مكان ژنومي را مورد بررسي قرار ‌دهند. بطوريکه نشانگرهاي چند مکاني12 قادرند بطور همزمان چندين مکان ژنومي را مورد بررسي قرار دهند. اين نشانگرها مبتني بر تكثير تصادفي DNA بواسطة آغازگرهاي اليگونوكلئوتيدي با توالي‌هاي انتخابي هستند، اين گونه نشانگرها را نشانگر‌هاي غالب نيز مي‌نامند. بنابراين امكان تشخيص حضور يا عدم حضور باند براي هر مکان وجود دارد ولي امكان تشخيص حالت‌هاي هتروزيگوت (A/-) يا هموزيگوت (a/a) براي آلل‌هاي مشابه وجود ندارد. در حاليكه نشانگرهاي يك مكاني13 از كاوشگرها يا آغازگرهاي ويژه براي مكان‌هاي ژني استفاده مي‌كنند و قادر به تكثير يا دورگگيري DNA با توالي‌هاي شناختهشده هستند. اين نشانگرها را نشانگرهاي هم‌بارز نيز مي‌نامند كه امكان تشخيص مكان‌هاي هموزيگوت و هتروزيگوت را به ما مي‌دهند(42).
روش‌هاي نشانگري پايه را مي‌توان به 2 دسته تقسيم كرد:
1-روش‌هاي غير مبتني بر PCR يا روش‌هاي مبتني بر هيبريداسيون.
2-روش‌هاي مبتني بر PCR
1-12-3-1 روش‌هاي غير مبتني بر PCR
روشهاي مولكولي مبتني بر هيبريداسيون از اولين نشانگرهايي هستند که در مطالعات گياهي مورداستفاده قرار گرفتند. اين نشانگرها شامل استفاده از آنزيم‌هاي برشي و روش‌هاي دورگگيري بودند (59). آندونوكلئارهاي هضمكننده، آنزيم‌هاي باكتريايي هستند كه قادر به شناسايي توالي‌ پاليندرم ويژه و برش DNA هستند كه اين برش سبب ايجاد قطعاتي با اندازه‌هاي مختلف مي‌شود. تغييرات درون توالي (مثل جهش نقطه‌اي)، جهشهاي بين مكاني (مثل حذف و جابجايي) و جهشهاي درون مكان آنزيمي مي‌توانند منجر به تفاوت طول قطعات بعد از برش آنزيمي شوند. نشانگرهاي RFLP14 و تعداد متفاوت رديف‌هاي تكراري (15VNTR)، نمونه‌هايي از نشانگرهاي مبتني بر هضم و هيبريداسيون هستند. در RFLP چندشكلي DNA بوسيلة هيبريداسيون كاوشگر (كه به روش شيميايي نشاندار شده است) با قطعاتDNA انتقال سادرنيافته انجام مي‌گيرد كه سبب ايجاد پروفايلهايي از قطعات DNA ميشود. نشانگر RFLP داراي چندشكلي نسبتاً زيادي است، توارث همبارز داشته و تكرارپذيري بالايي نشان مي‌دهد. در اين روش لكه‌هاي DNA حاصل از دورگ گيري را مي‌توان پاك كرد و قطعات انتقال سادرنيافته را دوباره با کاوشگرهاي 16‌ RFLP جديد (8 تا 10 مرتبه) مورد بررسي قرار داد. با اين وجود، اين روش‌ها به علت وقت‌گير بودن، داشتن مواد راديواكتيويتهي گرانقيمت و سمي و نياز به DNA با كيفيت و كميت بالا به طور وسيع مورداستفاده واقع نمي‌شوند. بعلاوه اين نشانگرها به اطلاعات اوليه از توالي DNA‌ جهت ساختن كاوشگر نياز دارند كه سبب پيچيدگي روش مي‌شود. اين محدوديت‌ها سبب شده است كه روش‌هاي با پيچيدگي كمتر مانند نشانگرهاي مبتني بر PCR توسعه يابند (42). بازرترين نوع اين مارکرها، RFLP ميباشد. VNTRها و ميکروستلايتها نيز در اين گروه قرار دارند. در اين نوع مارکرها يک قطعه DNA نشاندار شده (پروب) جهت هيبريداسيون استفاده ميشود. RFLP در سال 1980 توسط Botstain ابداع شد و دقت بسيار زيادي دارد، ليکن امروزه صرفا به دليل وقتگير و پرزحمت بودن آن، کمتر استفاده ميشود.
1-12-3-2 نشانگرهاي مبتني بر PCR
اين نشانگرها كه كاربرد آنها سير صعودي دارد، توسط موليس و همكارانش (1986) توسعه پيدا كرده و از واكنش‌هاي زنجيره‌اي پلي‌مراز (PCR) پيروي مي‌كنند. اين تكنيك شامل تكثير چندين قطعه DNA مجزا است كه توالي‌هاي اطراف آنها بسيار مشابه آغازگر مي‌باشد، اين نواحي بايد به قدر كافي به همديگر نزديك باشند تا تكثير انجام گيرد. استفاده از آغازگرهاي تصادفي محدوديت داشتن اطلاعات اوليه براي انجام PCR را ندارد. روش‌هاي مبتني بر PCR را مي‌توان به دو گروه: 1- روش‌هاي مبتني بر PCR تواليهاي غير ويژه. 2- روشهاي مبتني برPCR توالي‌هاي هدف17 تقسيم كرد. در اين قسمت تعدادي از نشانگرهاي مبتني بر PCR توضيح داده ميشود (42).
1-12-3-2-1 نشانگرRAPD18:
نشانگر RAPD، نخستين نشانگر مولکولي مبتني بر واکنش زنجيره پليمراز بود که براي بررسي تنوع ژنتيکي مورداستفاده قرار گرفت. ماركرهاي RAPD از طريق تكثير تصادفي DNA ژنومي و با استفاده از آغازگرهاي كوتاه ايجاد ميشوند. تفکيک قطعات حاصل بر روي ژل آگارز در حضور اتيديوم برومايد صورت ميگيرد، و در نهايت، زير نور ماوراء بنفش مشاهده ميگردد. اگرچه آغازگرها داراي تواليهاي تصادفي هستند، قادر به يافتن تواليهاي هومولوگ مناسب روي رشته DNA ميباشند. چندشكليهاي DNA بدليل نوآرايي يا حذف در محل اتصال آغازگرها يا ناحيه قابل تکثير ايجاد ميشوند (68).
1-12-3-2-2 نشانگر19AFLP:
براي غلبه بر محدوديت تکرارپذيري RAPD، تکنولوژي AFLP توسط شرکت هلندي کيجن20 توسعه پيدا کرد (68). نشانگر AFLP توسط هضم DNA با دو يا چند آنزيم برشي، اتصال آداپتور به دو انتهاي قطعات، PCR با آغازگرهاي اختصاصي و جداسازي قطعههاي حاصل روي ژل پلي اکريل اميد صورت ميگيرد (12). با توجه به نتايج بدستآمده از آن تکنيک مقرون به صرفه و داراي تکرارپذيري، ثبات و قابليت اطمينان بيشتري نسبت به مارکر RAPD ميباشد به همين دليل بطور وسيعي در تهيه نقشه کروموزومي گياهان مورداستفاده قرار گرفته است. در استفاده از اين مارکر بايد مراحل انجام کار با دقت و کيفيت بالا صورت گيرد (65).
1-12-3-2-3 نشانگر21SSR:
مورگانت و اوليويري در سال 1993 براي اولين بار ريزماهوارهها را در توالي گياهان گزارش کردند. ريز ماهوارهها يا رديف هاي تکراري ساده (SSR) شامل واحدهاي نوکلئوتيدي تکي تا شش تايي تکرار شونده هستند که در ژنوم بيشتر يوکاريوتها پراکندهاند (26). معمولاً تکرارهاي 1 تا 4 نوکلئوتيدي در ژنوم يوکاريوتها بيشتر يافت ميشوند. ريزماهوارهها به صورت طبيعي در نواحي غير کدکننده DNA از قبيل اينترونها و تـواليهاي بين ژني ديده ميشوند. ريـز مـاهوارهها معمولاً نـزديک بـه SINEs22 و LINEs23 ها و نزديک به عناصر شبه رتروترانسپوزونها ديده ميشوند (25). ريزماهوارهها به نواحي کدکننده ژنوم نيز متصل
شدهاند (18). ريزماهوارهها در نقشهيابي ژنومي، انگشتنگاري DNA، سازماندهي ژرمپلاسم و مطالعات سيتوژنتيکي و ارزيابي تنوع ژنتيکي درون جمعيتها استفاده ميشوند (12). ريزماهوارهها به دليل همبارز بودن و تبعيت از توراث مندلي و تشخيص آسان افراد هموزيگوس از هتروزيگوسي در بررسي تنوع ژنتيکي و انتخاب والدين برتر استفاده ميشوند (56). نشانگر SSR به دليل همبارز بودن و سطح بالاي چندشکلي و کاربرد آسان اين تکنيک، يک روش مناسب براي بررسي تنوع ژنتيکي به حساب ميآيد(18).
1-12-3-2-4 نشانگرISSR24:
زيتکيويز و همکاران در سال 1994 نشانگر مولکولي جديدي (مبتني بر PCR) به نام ISSR را معرفي کردند(76). اين تکنيک شامل تکثير قطعات DNA موجود در فواصل قابل تکثير بين دو توالي تکراري ريزماهواره است که در دو جهت مختلف آرايش يافتهاند. در اين نشانگرها معمولاً از ريز ماهوارههايي با طول 25-16 جفت باز به عنوان آغازگرهايي که در يک واکنش PCR مکانهاي ژنومي زيادي را مورد هدف قرار ميدهند استفاده ميکنند و به دليل طويل بودن آغازگرها، تکرارپذيري بالايي دارند، همچنين طول قطعات تکثيري با هم متفاوت ميباشند. تکرارهاي ريزماهواره که به عنوان آغازگر استفاده ميشوند، اصولاً دو، سه، چهار يا پنج نوکلئوتيدي ميباشند. اين آغازگرها مي توانند بدون باز اضافه (55،33و25) يا داراي 1 تا 4 باز اضافي به صورت لنگر در انتهاي ´3 يا ´5 باشند (76). نشانگرISSR تصادفي بوده و تکرارپذيري و چندشکلي بالايي دارد و در طيف وسيع



قیمت: تومان


پاسخ دهید