دانشگاه آزاد اسلامي
واحد علوم دارويي
دانشکده علوم و فناوريهاي نوين گروه زيست شناسي
پايان نامه براي دريافت درجه كارشناسيارشد “M.Sc”
گرايش سلولي و مولکولي
عنوان:
بررسي جهشهاي شايع ژن(MAPT , APOE) در بيماران ايراني مبتلا به آلزايمر ديررس
استاد راهنما:
جناب آقاي دکتر احمد ابراهيمي
نگارش:
مرضيه اناري
سال تحصيلي 93 – 1392

تقدير و تشکر:
اينک که با ياري خداوند متعال و لطف بي منتهايش، موفق به دفاع از پايان نامه كارشناسي ارشد خود ميشوم، در مطلع كلام و به رسم ادب بر خود لازم ميدانم
سپاس ويژه خود را تقديم بزرگواراني ميکنم که طي دوره کارشناسي ارشد به اينجانب کمک فراوان کردهاند.
از جناب آقاي دکتر احمد ابراهيمي به خاطر کلاننگري و در عين حال تواضع، صميميت، نظم، و پشتکار علميشان، احترام به دانشجو و بهره فراوان از دروس ايشان در مقطع كارشناسي ارشد، عليرغم مشغوليتهاي اجراييشان.
از سرکار خانم دکتر طاهره ناجي داور گرامي به خاطر کلان نگري و بهره فراوان از دروس ايشان در مقطع کارشناسي ارشد سپاس گذارم.
تقديم
تقديم به پروردگار بزرگ كه نعمت زندگي، پدر و مادر و خانواده را به من ارزاني داشت.
حاصل اين پژوهش را با اخلاص تمام به پدر و مادر مهربانم كه چون خورشيد عالم افروز، روشنايي بخش دنياي درونم بودند و در راه پيشرفت و تكامل، همواره سايه امن و سر پناه آسايش، و شوق پويايي و انگيزه تلاشم بودند، تقديم ميكنم.
اينك در گذر از مرحلهاي ديگر از زندگاني رو به فردا، دستان پر مهرشان را كه تنديس محبت است ميبوسم، و سر تواضع بر آستان پر مهرشان ميسايم، و آنان را به پاس زحمات بي دريغشان، و خداوند را به پاس نعمت پربهاي وجودشان شاكرم.
فهرست مطالب:
عنوانصفحه
خلاصه فارسي 1
فصل اول : کليات پژوهش
1- 1: بيان مسئله :3
2-1 :اهميت و ضرورت8
3-1: تعريف واژهها9
1-3-1:آلزايمر9
2-3-1 :ژن APOE10
3-3-1 :ژن MAPT10
4-3-1 : NFTs10
5-3-1 : ?APP (?-Amyloid Precursor Protein) :11
4-1 :هدف از اجراي تحقيق11
5-1 : فرضيه هاي پژوهش11
6-1 : سوال پژوهش11
فصل دوم: مروري بر متون گذشته
1-2: تاريخچه و کشف بيماري آلزايمر14
2-2:پاتولوژي بيماري15
3-2: انواع بيماري و ژنهاي دخيل در بيماري آلزايمر16
1-3-2:بيماري آلزايمر با شروع زودرس18
2-3-2 :بيماري آلزايمر با شروع ديررس22
3-3-2 : ژن APOE22
4-3-2: ژن MAPT (Microtule Associated Protein Tau)25
4-2 : بررسي تحقيقات انجام شده29
فصل سوم: مواد و روش ها
1-3: روش شناسي تحقيق35
1-1-3 : نوع مطالعه35
2-1-3 : جامعه آماري35
3-1- 3: معيار DSM-?35
4-1-3 : معيارهاي انتخاب بيماران37
5-1-3: روش جمع آوري دادهها37
5-1-3: تعريف عملياتي متغيرها و مقياس اندازهگيري37
6-1-3: ملاحظات اخلاقي37
2-3: روش اجرا38
1-2-3 : استخراج DNA38
2-2-3)روش استخراج DNA با استفاده از کلروفرم:41
روش تهيه محلولهاي مورد نيازجهت استخراج DNA:42
3-3) سنجش کيفيت و کميتDNA44
1-3-3) سنجش کميت و کيفيت DNA با استفاده از نانودراپ44
2-3-3) ارزيابي کيفيت DNA استخراج شده به کمک ژل آگارز (الکتروفورز افقي)44
4-3) ژنوتايپ کردن نمونه ها)ژنوتايپينگ)47
3-5: آناليز آماري51
مشخصات افراد شرکت کننده در مطالعه54
فصل چهارم: نتايج
1- 4: تجزيه و تحليل آماري براي پلي مورفيسم (G/A) 242557rs ژن MAPT54
1-1-4: مقايسه ژنوتيپ هاي پلي مورفيسم (G/A) 242557rs ژن MAPT در دو گروه بيمار و سالم54
2-1-4: مقايسه آلل هاي پلي مورفيسم G/A) 242557rs ژن MAPT در دو گروه بيمار و سالم55
2- 4: تجزيه و تحليل آماري براي پلي مورفيسم ژن APOE در دو گروه بيمار و سالم55
1-2-4 :مقايسه ژنوتيپهاي پلي مورفيسم (429358 rs ) و (7412rs) ژن APOE در در افراد2 ? APOE و4? APOE در دو گروه بيمار و سالم55
2-2-4: مقايسه آلل هاي پلي مورفيسم ژن APOE در دو گروه بيمار و سالم56
3-4 ) بررسي اثر متقابل ژنوتيپ هاي پلي مورفيسم G/A) 242557rs ژن MAPT با ژنوتيپ هاي ژن APOE57
4-4 : نتايج حاصل از PCR قطعات مورد نظر در ژن هاي MAPT و APOE57
فصل پنجم: بحث و پيشنهادات
1-5 ) بحث60
2-5 ) نتيجه گيري61
1-2- 5)نتايج پلي مورفيسم rs242557(G/A مربوط به ژن MAPT61
2-2-5) نتايج پلي مورفيسم (429358 rs ) و (7412rs) مربوط به ژن APOE62
3-5 ) پيشنهادات63
منابع
REFRENCE:65
Introduction:72
فهرست جداول:
عنوانصفحه
جدول 1-3مشخصات کلي پرايمرها 48
جدول 2 -3 49
جدول 3-3 برنامه مورد استفاده جهت انجام PCRژنMAPT 50
جدول 1-1-4: بررسي توزيع ژنوتيپ ها در دو گروه بيمار و کنترل 54
جدول 2-1-4: بررسي همسا ني توزيع آلل ها در دو گروه بيمار و سالم 55
جدول 1-2-4 : بررسي توزيع ژنوتيپ ها در دو گروه بيمار و کنترل 56
جدول 2-2-4: بررسي همساني توزيع آلل ها در دو گروه بيمار و سالم 56
فهرست شکل ها:
عنوانصفحه
شکل 1-1 ) در اين شکل نورون هاي سا لم با نورونهاي داراي شاخص هاي بيماري آلزايمر مقايسه شده است 3
شکل2-1 : در اين شکل ايزوفرم هاي گوناگون تائو به نمايش در آمده اند. 7
شکل 1-2 : پلاکهاي پيري آميلوئيد و NFT مشاهده شده در مغز بيماران مبتلا به آلزايمر 14
شکل2-2: سيستم ليمبيک و نواحي درگير در بيماري آلزايمر 15
شکل1-4-4 : محصول PCR مربوط به ژن MAPT ، همانگونه که مشاهده مي شود،طول قطعه ي کنترل ، موتانت و نرمال به ترتيب 340 ، 167،228 نو کلئو تيد مي باشند. 58
شکل 2-4-4: محصول PCR مربوط به ژن APOE در دو جايگاه (لوکوس) 112و 158. 58
چکيده :
مقدمه : بيماري آلزايمر يک اختلال مولتي فاکتوريال بوده است و شايع ترين عامل دمانس در جهان ميباشد. بنابراين قويترين فاکتور خطر براي ابتلا به بيماري آلزايمر رسيدن به سن پيري ميباشد. از آنجا که يکي از شاخصهاي بيماري آلزايمر گرههاي نوروفيبريلاري درون سلولي (متشکل از فيلامنتهاي شديدا فسفريله تائو ) ميباشد و با توجه به اينکه ژنMAPT کدکننده پروتئين تائو است و اين پروتئين با بيماري آلزايمر در ارتباط مستقيم است بنابراين پلي مورفيسم شايع (G/A) 242557rs ژن MAPT ميتواند با ريسک ابتلا به بيماري آلزايمر ارتباط داشته باشد و APOE هم يک ريسک فاکتور براي اين بيماري شناخته شده است. بنابراين رابطه بين بيماري آلزايمر و تشکيل گرههاي نوروفيبريلاري انکار ناپذير است.
روش کار: در اين مطالعه پلي مورفيسم (G/A) 242557rs در ژنMAPT و پلي مورفيسم (429358 rs ) و (7412rs) در ژن APOE در 57 فرد سالم و 50 فرد بيمار به روش Tetra Arms PCR مورد بررسي قرار گرفتند.
يافتهها : در پلي مورفيسم (G/A) 242557rs در ژن MAPT ،فراواني ژنوتيپ AG و آلل G در افراد بيمار به طور معناداري از افراد سالم بيشتر بود، (به ترتيب 64% و 36% در برابر 1/42% و 8/22% با 01/0? Pvalue . در پلي مورفيسم (429358 rs ) و (7412rs) در ژن APOE ، فراواني ژنوتيپ 4/?4? و آلل 4? در افراد بيمار به طور معناداري از افراد سالم بيشتر بود. (به ترتيب 4/38% و 7/57% در برابر 8/3% و 8/28% با009 /0? Pvalue).
نتيجه گيري : به نظر مي رسد که در پلي مورفيسم(G/A) 242557rs در ژن MAPT در جمعيت ايراني ، ژنوتيپ AG و آلل G در اين جمعيت داراي نقش ريسک فاکتوري براي بيماري آلزايمراست.
به نظر ميرسد که در پلي مورفيسم (429358 rs ) و ( 7412rs ) در ژن APOE ، در جمعيت ايراني ، ژنوتيپ 4/?4? و آلل 4? در اين جمعيت داراي نقش ريسک فاکتوري براي بيماري آلزايمر است.
واژههاي کليدي : بيماري آلزايمر ، ژن MAPT ، ژن APOE ،گرههاي نوروفيبريلاري
فصل اول:
کليات تحقيق
1- 1: بيان مسئله :
بيماري آلزايمر1 شايع ترين بيماري تخريب کننده عصبي2 ميباشد (1) که از نظر ژنتيکي هتروژن بوده و تاکنون بيش از 26 ميليون نفر از جمعيت جهان به آن مبتلا شده اند (2و3).
بيماري آلزايمراز نظر باليني, با اختلالات شناختي ,اختلالات زباني و مهارتهاي حرکتي و تغييرات رفتاري همراه است (2) و درگير کننده مناطقي خاص از مغز از جمله لوبهاي گيجگاهي3,هيپوکامپ, بخشي از کورتکس و بخش کوچکي از لوب پيشاني4 ميباشد (4) و از نظر پاتولوژيکي با وجود پلاکهاي پيري خارج سلولي5 وگرههاي داخل سلولي نوروفيبريلاري6 و فقدان ارتباطات سيناپسي درون کورتکس انتورينال7 مشخص ميشود (5).
شکل 1-1 ) در اين شکل نورون هاي سا لم با نورونهاي داراي شاخص هاي بيماري آلزايمر مقايسه شده است
که همانگونه که ملاحظه ميشود در نورونهاي آلزايمري پلاکهاي بتا آميلوئيدي خارج سلولي و گرههاي نوروفيبريلاري داخل سلولي که از شاخصهاي بيماري آلزايمر ميباشد به خوبي قابل مشاهده ميباشد.
پلاکهاي پيري از رشتههاي 8 نانومتري از پپتيدهاي 42-40 اسيدآمينهاي به نام آميلوئيد بتا 8درست شدهاند که از پروتئوليز يک پروتئين بزرگتر به نام پروتئين پيش ساز آميلوئيد9 حاصل ميشوند (5و6). شکستن APP توسط دو پروتئاز به نام بتا -سکرتاز10 و گاما -سکرتاز 11سبب توليد پپتيد آّميلوئيد بتا ميشود که سريعا به صورت فيبريلهايي تجمع مييابند. دو پروتئين مرتبط با بيماري آلزايمر به نام هاي پرسينيلين1 و پرسينيلين 2 از اجزء کاتاليتيک گاما-سکرتاز ميباشند (5).
گرههاي داخل سلولي نوروفيبريلاري از رشتههايي درست شدهاند که ترکيب عمده آنها از پروتئبني به نام تائو12 ميباشد که پروتئيني متصل شونده به ميکروتوبول 13ميباشد. واکنش ديناميک بين پروتئين تائو و ميکروتوبولها توسط فسفريلاسيون تنظيم ميشود. تائوي فسفوريله شده در مقايسه با تائوي غير فسفوريله شده تمايل چسبندگي پايينتري به ميکروتوبولها دارد (7). ميزان فسفوريلاسيون در تائوي جدا شده از گرههاي نوروفيبريلاري چندين برابر بيشتر از تائوي طبيعي ميباشد (8). پروتئين تائو به فيلامنت هاي اکتين14 و اسپکترين15 متصل ميشود که از طريق اين واکنشها پروتئينهاي تائو احتمالا در ميا نکنش ميکروتوبولها با ساير اجزاي اسکلت سلولي نظير نوروفيلامنتها اثر ميگذارند. در انواعي از بيماريهاي نورودژنراتيو (به جز آلزايمر) که در مجموع به آنها تائوپاتيها16 اطلاق ميشود گرههاي نوروفيبريلاري تجمع مييابد بدون اينکه رسوبات بتا آميلوئيدي ديده شود و بر اساس نوع تائوي اجتماع يافته که به عنوان بار کد 17عمل ميکنند پنج نوع تائو پاتي طبقه بندي شده است (9).
بيماري آلزايمر بر اساس سن شروع بيماري به انواع زودرس18 و ديررس19 تقسيم ميشود که در شکل زودرس (آلزايمر خانوادگي) سن شروع بيماري پايين تر از 65 سال است در حالي که در شکل ديررس سن شروع بيماري بالاتر از 65 سال ميباشد (10). عمده موارد بيماري از نوع ديررس (اسپوراديک) مي باشد (11) به نحوي که بيش از 97% بيماري آلزايمري از نوع ديررس ميباشد و تنها 3% بيماران آلزايمري از نوع زودرس ميباشد (12).
چندين ژن دخيل در ايجاد بيماري آلزايمر زودرس شناسايي شدهاند که از مهمترين آنها ميتوان به پرسينيلين 1 بر روي کروموزوم14, پرسينيلين 2 بر روي کروموزوم 1 و پروتئين پيش ساز بتا آميلوئيد بر روي کروموزوم 21 اشاره کرد که جهش در اين سه ژن مسئول 40% از موارد زودرس بيماري است. ژنهاي دخيل در آلزايمر ديررس به صورت يک ريسک فاکتور عمل ميکنند و ژنهاي بسياري در اين زمينه به عنوان ريسک فاکتور مورد مطالعه قرار گرفته اند که شناخته ترين آنها ,ژن آپوليپو پروتئين20 واقع بر روي کروموزوم 19 ميباشد (13,14 و15). آپوليپو پروتئين E(APOE), ليپوپروتئين اصلي در مغز است که در نقل و انتقال ليپيدها و به ويژه کلسترول دخيل ميباشد. ژن کد کننده پروتئين(APOE سه آلل دارد که توارث آلل (4 (APOE? قويترين فاکتور خطر براي بيماري آلزايمر تک گير ميباشد (16).
چندين فرضيه ارائه شدهاند که مرک نوروني ناشي از گرههاي داخل سلولي نوروفيبريلاري و آميلوئيد بتا را بيان ميکنند. فرضيه آبشار آميلوئيد21 ادعا ميکند که آميلوئيد بتا سبب افزايش يا ايجاد پاتولوژيکي گرههاي داخل سلولي نوروفيبريلاري ميشود. فرضيه اي ديگر, آسيب اکسيداتيو مغز, به عنوان يک عامل براي بيماري آلزايمر اسپوراديک ميباشد و فرضيه اي ديگر , نقص ميتوزي را به عنوان يک دليل تخريب نوروني در آلزايمر معرفي ميکند (1).
ژن تائو kb135 طول دارد و داراي 16 اگزون ميباشد که بر روي کروموزوم شماره 17در موقعيت21 q17 قرار دارد و پروتئين کد شده توسط اين ژن , داراي نقش حياتي در سطح سلولي ميباشد. نقش عمده فيزيولوژيکي اين پروتئين ,پيشبرد پايداري و تجمع شبکه ميکروتوبولي ميباشد که اين شبکه ميکروتوبولي در انتقالات آکسوني22 در نورون ها داراي اهميت ميباشد (17,18). ژن تائو داراي دو جزيره CPG 23ميباشد که يکي از جزاير با پروموتر و جزيره ديگر با اگزون 9 در ارتباط ميباشد. جزيره CPG مربوط به بخش پروموتر شبيه پروموترهاي ويژه نورون ميباشد (19).
در تمام طول لوکوس ژنومي MAPT دو هاپلوتايپ شناسايي شدهاند که اين هاپلوتايپ ها را H1 وh2 مينامند که واريانت هاي H1 با بيماري آلزابمر در ارتباط ميباشند (16,20).
در مغز بالغين شش ايزوفرم از تائو در اثر پردازش متناوب 24اگزون هاي 2,3 و 10حاصل ميشود که سه تا از اين ايزوفرمها داراي سه ناحيه تکراري متصل شونده به ميکروتوبول (3R) ميباشند که توسط اگزونهاي 12-9 کد ميشوند . اگزون 10 نيز دومين ديگري را کد ميکند که داشتن اين دومين مربوط به اگزون10 باعث توليد سه ايزوفرم ديگر از تائو ميشود که داراي چهار ناحيه اتصال به ميکروتوبول ميباشد و ايزوفرمهاي 4R-tau ناميده ميشوند (21). ايزوفرم هاي 3R ,4R يا بدون اسيدآمينه دخولي (0N) و يا داراي 29 اسيدآمينه دخولي 1N)) و يا داراي 58 اسيدآمينه دخولي (2N) مي باشند.در مفز انسان نسبت ايزوفرم هاي 3R, به 4R در حدود يک مي باشد و ايزوفرم هاي 1N, 0N و2N به ترتيب 54% ,37, %9 % از کل تائو را تشکيل ميدهند. در مغز جنين کوتاه ترين ايزوفرماز تائو 3R/0N)) که داراي352 اسيد آمينه است بيان ميشود در حالي که شش ايزوفرم در زمان بعد از تولد بيان مي شوند (22). پروتئن تائو از طريق اين تکرارها به ميکروتوبول ها متصل شده و سبب اجتماع 25آنها ميشود (17). نشان داده شده است که ايزوفرم هاي 4R-tau در مقايسه با ايزوفرمهاي 3R-tau تمايل بيشتري براي اتصال به ميکروتوبولها دارند. اين فزضيه ارائه شده است که افزايش شکل 4R-tau سبب ايجاد ساختار سخت و غيرقابل انعطاف ميکروتوبولي ميشود (23).
پروتئين تائو يک سري تغييرات پس از ترجمه اي26 را مي گذراند که سبب پايداري آن مي شود. بر روي پروتئين تائو بيش از 40 جايگاه فسفوريلاسيون شناسايي شدهاند که اين جايگاه ها اغلب باقيماندههاي سريني و ترئونيني ميباشند که بعد از پرولين آمدهاند (23).

شکل2-1 : در اين شکل ايزوفرمهاي گوناگون تائو به نمايش در آمدهاند.
همانگونه که مشاهده ميشود طويل ترين ايزوفرم داراي 441 اسيد آمينه ميباشد و داراي اگزونهاي 2،3 و 10 است در حالي که کوتاهترين ايزوفرم داراي 352 اسيد آمينه ميباشد و فاقد اگزون هاي 2،3 و 10 است.
ژن تائو در بيماري PSP 27 داراي سه پلي مورفيسم است که دو پلي مورفيسم در پروموتر( A?G درموقعيت -44 وC?G در موقعيت 221- ) و يک پلي مورفيسم دراينترون شماره يک (G? A در موقعيت309) ميباشد که اين پلي مورفيسم ايجاد دو هاپلوتايپ H1P وh2p است که هاپلوتايپ h2pبا Pvalue?0.00217 با بيماريPSP در ارتباط ميباشد. از آنجا که ژن تائو در بيماري آلزايمر حائز اهميت ميباشد اين تغيير پروموتري ديده شده در پروموتر تائو در بيماري PSP ممکن است در بيماري آلزايمر نيز مهم باشد (24).
بين اگزون 9 و10 از ژن تائو يک ژن بدون اينترون ،به نام سايتوهين28 قرار گرفته است و الگوي بيان آن بسيار شبيه الگوي بيان ژن تائو ميباشد (14,16,25). اين ژن همولوگ مشخصي ندارد (26) و تنها داراي يک اگزون ميباشد. عملکرد اين ژن نامشخص مي باشد و در مورد ژن بودن آن هنوز اختلاف نظر وجود دارد. ولي در فرايندهاي پاتولوژيک در بيماري PSP تاثير داشته است (27،28).
2-1 :اهميت و ضرورت
بيماري آلزليمر يک بيماري تخريب عصبي است که کل زندگي فرد مبتلا را تحت تاثير خود قرار ميدهد. اين بيماري که يک بيماري مولتي فا کتوريال ميباشد نتيجه عوامل ژنتيکي و محيطي است. در سا ل 2006، حدود 6.6 2 ميليون نفر از جمعيت جهان به اين بيماري مبتلا بودهاند و طبق آخرين آمار موجود در 1375؛ حدود 182 هزار نفر بيمار مبتلا به آلزايمر در ايران وجود داشته است که اين تعداد در سال 1386 بين 300-250 هزار نفر بر آورد ميشود (38). در جمعيت ايالت متحده آمريکا 4-3 ميليون نفر به بيماري آلزايمر ديررس مبتلا ميباشند و هر سال 350 هزار نفر به اين جمعيت اضافه ميشوند (39). شيوع اين بيماري از 20% براي افراد بالاي 75 سال به 30% براي افراد بالاي 85 سال افزايش پيدا ميکند و 5% از افراد با سن 65 سال يا بالاتر به آن مبتلا ميباشند. از آنجايي که بيماري آلزايمر ديررس (که در سنين بالاي 65 سال بروز مييابد)، بيش از 97% از موارد بيماري آلزايمر را به خود اختصاص داده است و با توجه به اينکه تشخيص اين بيماري بر اساس بررسيهاي باليني و نوروسايکولوژيکي است که روندي زمان بر و پرهزينه مي باشد. بنابراين تشخيص بيماري با استفاده از آلل يا مارکري خاص که به طور مستقيم با بيماري مرتبط است ميتواند در تشخيص سريع بيماري و احيانا درمان آن موثر واقع گردد (40).
با توجه به اينکه گرههاي نوروفيبريلاري (متشکل از فيلامنتهاي شديدا فسفريله تائو) از شاخصهاي بيماري آلزايمر (از نوع ديررس و زودرس) ميباشند در کشور ما نيز با وجود جوان بودن جمعيت کنوني ,شاهد رشد جمعيت سالمندان خواهيم بود و به نظر ميرسد که در 20 الي 30 سال آينده با پير شدن جمعيت جوان فعلي, شيوع بيماري آلزايمر افزايش خواهد يافت. لذا مطالعه و شناسايي فاکتورهاي خطر ساز به ويژه بيومارکرهاي ژنتيکي ميتواند ما را در شناسايي زودرس بيماري , درمان هدفدار و نيز شناسايي افراد در معرض خطر در خانوادههايي با خطر بالاي ابتلا به آلزايمر ياري رساند.
از اين رو با توجه به مطالعات قبلي در ساير کشورها و عدم وجود مطالعه خاصي اثر اين دو ژن در ارتباط با بيماري آلزايمر در جمعيت ايراني و با توجه به اينکه ژنMAPT کدکننده پروتئين تائو است و اين پروتئين با بيماري آلزايمر در ارتباط مستقيم است و APOE هم يک ريسک فاکتور براي اين بيماري شناخته شده است لذا نياز به انجام مطالعاتي نظير اين ,ضروري احساس ميشود.
3-1: تعريف واژهها
1-3-1:آلزايمر
بيماري آلزايمر شايع ترين علت زوال عقل29 در دوران ميان سالي و پيري است که با نقص در فعاليتهاي شناختي ،از دست دادن حافظه30،از دست دادن توانايي انجام حرکات هدفدار و تغييرات شخصيتي همراه است . در اين بيماري مناطق خاصي از مغز چون لوپ خاي گيجگاهي ،هيپوکامپ، بخشي از کورتکس و بخش کوچکتري از لوب پيشاني درگير ميشوند (1). اين بيماري ، از نظر ژنتيکي هتروژن31 بوده و تحت تاثير محيط و ژنتيک است که شيوع آن از حدود 3 % در ميان افراد 65 ساله تا حدود 50 % در ميان افراد 85 ساله تغيير ميکند. بيماري آلزايمر بر اساس سن شروع بيماري به دو حالت زودرس (شروع در سن کمتر از 65 سال) و ديررس (شروع در سن بيشتر از 65 سال) تقسيم ميشود . بيش از 17 % بيماران، دچار آلزايمر از نوع ديررس و تک گير32 (بدون سابقه خانوادگي) هستند، در حاليکه آلزايمر زودرس تنها 3 % از جمعيت را شامل ميشود (5 ).
2-3-1 :ژن APOE
ژن آپوليپو پروتئين33 واقع بر روي کروموزوم 19 ميباشد (13,14 و15). آپوليپو پروتئين E(APOE), ليپوپروتئين اصلي در مغز است که در نقل و انتقال ليپيدها و به ويژه کلسترول دخيل ميباشد. ژن کد کننده پروتئين(APOE) سه آلل دارد که توارث آلل (4 (APOE? قويترين فاکتور خطر براي بيماري آلزايمر تکگير ميباشد (16).
3-3-1 :ژن MAPT
يکي از ژنهاي تازه شناخته شده است که بر روي کروموزوم شماره 17 در موقعيت17q21 قرار دارد و پروتئين کد شده توسط اين ژن , داراي نقش حياتي در سطح سلولي ميباشد. نقش عمده فيزيولوژيکي اين پروتئين , پيشبرد پايداري و تجمع شبکه ميکروتوبولي ميباشد که اين شبکه ميکروتوبولي در انتقالات آکسوني34 در نورونها داراي اهميت ميباشد (17,18).
4-3-1 : NFTs
يکي از ويژگيهاي پاتولوژيک بيماري آلزايمرگرههاي نوروفيبريلاري ميباشد که همراه با پلاکهاي بتا آميلوئيدي ديده ميشود. اين گرهها ترکيبي از پروتئين تائوي به شدت فسفوريله ميباشد که از دو نوع فيلامنت به نامهاي فيلامنت هليکال جفتشده 35و فيلامنتهاي صاف 36درست شدهاند که ميزان PHFs بسيار بيشتر از SFs است. تائو از پروتئينهاي واکنش دهنده با ميکروتوبولها مي باشد که در شرايط طبيعي در آکسونها و در شرايط پاتولوژيک به صورت کلافي در جسم سلولي نورونها قرار ميگيرد. در ابتداي بيماري اين کلاف در نورون هاي هرمي موجود در کورتکس انتورينال، ناحيه زمينهاي37 و ناحيه CA1هيپوکامپ، تشکيل ميشوند و با گسترش بيماري ،تعداد اين کلافها رو به گسترش نهاده وکورتکس پارينال 38را نيز درگير ميکنند (4،21 ، 41،42).
5-3-1 : ?APP (?-Amyloid Precursor Protein) :
اين ژن اولين ژن شناخته شده در رابطه با استعداد براي ابتلا به بيماري آلزايمر خانوادگي است که داراي پردازش متناوب بوده و ايزوفرمهايي از پروتئين تبا آميلوئيد را کد ميکند که طولانيترين آنها ايزوفرمي غشاء گذر با اسيد آمينه ميباشد. پروتئين ?APP توسط دو آنزيم پروتئوليتيک به نامهاي گاما و بتا سکرتاز تجزيه شده و بتا آميلوئيدهايي با طول 42-40 اسيد آمينه را توليد مينمايند که سميت بتا آميلوئيد 42 اسيد آمينه از سايرين بيشتر است (28).
4-1 :هدف از اجراي تحقيق
(هدف اصلي) : بررسي ارتباط پلي مورفيسم شايع (G/A) 242557rs در ژن MAPT و ابتلا به آلزايمر ديررس در بيماران ايراني و گروه کنترل (افراد سا لم).
(هدف جانبي) : بررسي ارتباط هاپلوتايپ 4? از ژن APOE و ابتلا به آلزايمر ديررس در بيماران ايراني و گروه کنترل (افراد سا لم).
(هدف كاربردي) : استفاده از نتايج , جهت غربالگري بيماران مستعد يا در معرض خطر ابتلا به آلزايمر.
5-1 : فرضيه هاي پژوهش
بين فراواني ژنوتايپ ?4 از ژن APOE در بيماران مبتلا به آلزايمر و گروه کنترل (افراد سالم) تفاوت معناداري وجود دارد.
بين فراواني پلي مورفيسم شايع (G/A) 242557rs ژن MAPT در بيماران مبتلا به آلزايمر و گروه کنترل (افراد سا لم) تفاوت معناداري وجود دارد.
6-1 : سوال پژوهش
مساله اصلي در اين پژوهش پاسخ به اين سوال است که آيا بين فراواني پلي مورفيسمهاي مورد مطالعه در ژن MAPT(Microtubule- associated protein tau) و ژن APOE در جامعه بيماران آلزايمري و جامعه کنترل (افراد سالم) در جمعيت ايراني تفاوت معناداري وجود دارد, به گونه اي که بتوان آن را به عنوان يک فاکتور خطر ابتلا به آلزايمر در جمعيت ايراني محسوب کرد.
فصل دوم:
مروري بر متون گذشته
1-2: تاريخچه و کشف بيماري آلزايمر
در سال 1906، در سي و هفتمين گردههمايي روانپزشکان آلماني در توبينگن،آلوئيس آلزايمر39،سرپرست آزمايشگاه آناتومي دانشگاه لودويگ-ماکسي ميليانز 40در مونيخ اولين مورد بيماري را همراه با آتروفي41 کورتکس و NFT42 و رسوبات بتا آميلوئيدي ،در يک زن 51 ساله گزارش کرد. در سال 1910, روانپزشک آلماني به نام اميل کرپلين43 اين بيماري را بيماري آلزايمر (AD ) 44 ناميد (10,43). شيوع اين بيماري از 3% در ميان افراد 85 ساله، تغيير ميکند و تعداد افراد بيمار تا سال 2050، حدود 100 ميليون نفر تخمين زده شده است (10) .بيماري آلزايمر ،جزء ده بيماري کشنده در کشورهاي در حال توسعه محسوب ميشود (44،45). در آمريکا آلزايمر چهارمين دليل مرگ و اصليترين دليل زوال عقل ميباشد که در حال حاضر علاج يا درمان موثري براي اين بيماري وجود ندارد (46) و از اقتصادي بارسنگيني را بر دوش جامعه تحميل ميکند براي مثال در آمريکا به ازاي هر فرد آلزايمري ساليانه 42 هزار دلار صرف ميشود (47 ).
شکل 1-2 : پلاکهاي پيري آميلوئيد و NFT مشاهده شده در مغز بيماران مبتلا به آلزايمر
2-2:پاتولوژي بيماري
بيماري آلزايمر يک بيماري نورودژنراتيو ميباشد که از نظر باليني با زوال عقل مشخص ميشود (48). از ويژگيهاي باليني آن ،ميتوان به از دست رفتن حافظه ،تغييرات شخصيتي و از دست دادن فعاليتهاي شناختي اشاره کرد که ويژگي اخير ميتواند شامل عدم توانايي در سخن گفتن45 عدم تشخيص افراد و اشياء با وجود سا لم بودن حواس46 و عدم انجام فعاليتهاي حرکتي با وجود سيستم حرکتي سالم47 باشد (42).
از مهمترين ويژگيهاي پاتولوژيکي بيماري آلزايمر از دست رفتن پيشرونده نورونها و ايجاد پلاکهاي آميلوئيدي48 و مواد رشتهاي سيتوپلاسمي ميباشد که گره هاي نورو فيبريلاري49 خوانده ميشود. ترکيب اصلي گرههاي نورو فيبريلاري را اشکال غير طبيعي و به شدت فسفوريله شده50 تائو تشکين ميدهد. اين در حالي است که پلاکهاي پيري51 (پلاکهاي آميلوئيدي) از رشتههاي پپتيدي هشت نانومتري به نام بتا آميلوئيد ،تشکيل شدهاند که نواحي مختلف مغز از جمله هيپوکامپ، آميگدال و کورتکس انتورينال را در گير ميکنند (10). پلاکهاي پيري که در مغز افراد کهنسال به ميزان کم يافت ميشود در مغز بيماران آلزايمري به ميزان بسيار فراوان ديده ميشود و تنها در بيماري آلزايمر ديده ميشود.
شکل2-2: سيستم ليمبيک و نواحي درگير در بيماري آلزايمر
بنابراين براي اين بيماري ويژه ميباشد (46). به نظر ميرسد که ميزان گوناگوني ژنومي52 در جمعيت آلزايمري در مقايسه با جمعيتهاي نرمال بدون هيچگونه سابقه بيماري ،3-2 برابر بالاتر باشد (46و48).
جايگاه تشکيل پلاکهاي آميلوئيدي در تعيين نوع پلاک ها ، به عنوان فاکتوري اساسي عمل ميکند. اين بدان معني است که برخي نواحي داراي پلاکهاي مخصوص خود ميباشند (46,48). پلاکهاي تيپيکال از سه جز تشکيل ميشوند که آميلوئيد، نوريت ها 53و گلياي واکنش دهنده54 مي باشند. نوريتهاي swollen داراي اجسام ضخيمي55 ميباشند که مي توان آنها را با آنتي بادي هاي يوبيکويتين نشاندار کرد. نوريت هاي swollen در مغز بيماران آلزايمري شامل گرههاي پيچ خورده جفت ميباشد اين در حالي است که در مغز افراد سالم ،اين فيلامنتها ديده نميشود (46,47). يافته هايي دال بر موتاسيون در بيماري17 FTDP- 56که نوعي ديگر از بيماري نورودژنراتيو است(که همراه با تشکيل NFTs است) ميرساند که تائو به تنهايي توانايي ايجاد نورودژنراسيون را دارا است. لذا مطالعه مکانيسمهاي مولکولي شکلگيري NFTs ممکن است ديدگاهي مهم را در باب نورودژنراسيون در بيماري آلزايمر ارائه ميکند (46, 48, 51 )گر چه پلاکهاي پيري از ويژگيهاي بيماري آلزايمر ميباشد NFTsدر سطح وسيع تري رخ ميدهد و در بيماري نورودژنراتيو ديگر نيز مشاهده ميشود که اين مطلب بيانگر آن است که پلاکهاي پيري در فرايندهاي پاتولوژيکي تخصصي بيماري آلزايمر دخيل ميباشد در حالي که NFT در فرايندهاي عمومي نورودژنراسيون اثر گذار است. NFTs را به عنوان دومين مشخصه بيماري آلزايمر قلمداد ميکنند زيرا کمتر ويژه ميباشد و علاوه بر آلزايمر در ديگر بيماريهاي نورودژنراتيو نظير17 PSP,FTDP- نيز مشاهده مي شود (1).
3-2: انواع بيماري و ژنهاي دخيل در بيماري آلزايمر
بيماري آلزايمر، بيماري پيچيده و از نظر ژنتيکي هتروژن ميباشد که پيچيدگي آن بر فقدان الگوي توارثي خاص ، دلالت ميکند و هتروژن بودن آن، بيانگر دخالت پلي مورفيسمها و موتاسيونهاي موجود در چندين ژن، به همراه عوامل غير ژنتيکي در اين بيماري است )2،49). به نظر ميرسد که نقص شناختي متوسط قبل از بروز بيماري آلزايمر رخ ميدهد. نقص شناختي متوسط57 مرحلهاي گذرا بين پير شدن طبيعي مغز و زوال عقل ميباشد و تقويت کننده اين ديدگاه است که قبل از بروز بيماري آلزايمر تغييرات سيناپسي رخ ميدهند. ضعف سيناپسي به طور عموم در پاتولوژي بيماري آلزايمر ديده ميشود و شاخص عملکرد بد سيناپسي در آلزايمر ميباشد (50).
داشتن ضعف شناختي متوسط که رخدادي هتروژن ميباشد ريسک ابتلا به بيماريهاي زوال عقل و از جمله آنها آلزايمر را ده برابر ميکند (46،48). از اواخر قرن بيستم بيماري آلزايمر شايعترين دليل زوال عقل در جمعيت ژاپن توده است. بيش از 30 ژن مختلف که در سراسر ژنوم انسان پراکنده شدهاند ممکن است درآبشارهاي اتيو پاتولوژيکي58 بيماري آلزايمر درگير باشند که منجر به نورودژنراتيو در بيماري آلزايمر ميشود (51) .
بيماري آلزايمر بر اساس سن شروع آن به دو نوع طبقه بندي ميشود که آلزايمر با شروع زودرس59 (شروع در سنين کمتر از 65 سال) و آلزايمر با شروع ديررس60(شروع در سنين بيشتر از65 سال) خوانده ميشوند. در هر دو نوع بيماري آلزايمر وجود پلاکهاي بتا آميلوئيدي و گره هاي نوروفيبريلاري از مشخصات بيماري ميباشند. ساير فاکتورهاي گيجکننده در پاتوژنز بيماري آلزايمر شامل سيکل سلولي معيوب ،بي نظمي در متابوليسم انرژي نوروني به دليل نقص در فعاليتهاي ميتوکندريايي و مکانيسمهاي التهابي61 و فشار اکسيداتيو 62و نقص در عملکرد پروتئوزومها ميباشد (26).
بخش عمده موارد بيماري آلزايمر از نوع ديررس ميباشد به گونه اي که بيش از 97% بيماران آلزايمري ،از نوع اسپوراديک ميباشند و تنها 3% بيماران آلزايمري از نوع زودرس ميباشند پس از سن، سابقه خانوادگي، دومين عامل خطر در اين بيماري است (12و52).
1-3-2:بيماري آلزايمر با شروع زودرس
مدل توارث در آلزايمر براي هر نوع متفاوت است. اکثر موارد آلزايمر خانوادگي و اسپوراديک داراي توارث پيچيده ميباشند. در حالي که حدود10% از موارد آلزايمر خانوادگي اتوزومال غالب دارند (53). در بيماري آلزابمر زودرس دليل اصلي بيماري يک موتاسيون ژنتيکي ميباشد (26). بيماري آلزابمر زودرس(خانوادگي)، در اثر موتاسيونهاي نادر از نوع بد معني با توارث اتوزومال غالب ايجاد ميشود که اين موتاسيونها در ژنهاي APP,Presenilin1,Presenilin2 رخ مي دهد (26).
ژن پروتئين پيشساز آميلوئيد.که در رابطه با استعداد63 براي ابتلا به بيماري آلزايمر خانوادگي شناسايي شد. که بر روي کروموزوم 21 قرار دارد(46،48،51). از پردازش متناوب حداقل سه اگزون از ژن APP، 8 ايزوفرم APP، توليد ميشود که از که معروفترين آنها ميتوان به سه گونهي 695 ،751،770 اسيد آمينهاي اشاره کرد که در سلولها دچار تغييرات پس از ترجمه64 ميشوند و از جمله اين تغييرات ميتوان به اتصال قند65،سولفاسيون و فسفريلاسيون66 را نام برد (51). APPبلافاصله پس از ساخته شدن در شبکه آندوپلاسمي، دچار N-گليکوزيلاسيون ميشود و در دستگاه گلژي دچار N- گليکوزيلاسيونهاي بعدي و o- گليکوزيلاسيون ميشود. جالب توجه اين است که 80-70% از APP نابالغ N-گليکوزيله شده، تجزيه ميشود که اين عمل احتمالا در شبکه آندوپلاسمي رخ ميدهد و تنها 30-20% به دستگاه گلژي ميرسد. در خلال گذر از شبکه آندوپلاسمي به سطح سلول، APPهمچنين دچار سولفاتاسيون وفسفوريلاسيو نميشود (46،48،51).
از پردازش متناوب در حداقل سه اگزون از اگزونهاي ژن ?APP ايزوفرم هاي گوناگوني از اين ژن حاصل ميشود که فراوانترين آنها داراي51 7 اسيدآمينه ميباشد. ايزوفرم51 7 اسيدآمينه اي اگزون 7 را دارا ميباشد اين در حالي است که ايزوفرم 695 اسيدآمينهاي از ?APP که به طور انتخابي در نورونها بيان ميشود، فاقد اگزون7 ميباشد (54). APP داراي يک دومين 56 اسيد آمينهاي است که به علت شباهت به خانوادهاي از پروتئازها موسوم به خانواده مهارکننده پروتئازKunitz ، به نام دومين مهارکننده پروتئاز67 Kunitz ، (KPI) ناميده ميشود (48،51 ،55). APP77 علاوه بر دارا بودن دومين KPI داراي يک توالي 19 اسيد آمينهاي ميباشد که با آنتي ژن OX-2 MRC داراي همولوژي ميباشد (46،51،55). APP در همه بافتها68 بيان ميشود ولي بيشترين ميزان بيان آن در مغز و کليه ميباشد. در حالي که فراوان ترين ايزوفرم از APP ، ايزوفرم 751مي باشد .نورونها به طور اختصاصي عمدتا ايزوفرم 695 را بيشتر بيان ميکنند (54). از لحاظ ساختاري APP از نوع پروتئين غشايي انتگرال نوع يک69 ميباشد که داراي زنجيرههاي کربوهيدراتي از نوع متصل به o و متصل به N ميباشد ( 46،51،54 ،55). اولين 28 اسيدآمينه مربوط به توالي آميلوئيد بتا در بخش خارج سلولي قرار دارد و 15-11 اسيد آمينهاي باقيمانده در عرض غشاء فرو رفته است اين بدان معني است که براي توليد آميلوئيد بتا از APP بايد حد اقل دو شکست پروتئوليتيکي رخ دهد و در نهايت دومين سيتوپلاسمي مربوط به APP داراي يک موتيف دروني NPTY ميباشد که در اندوسيتوز آن ايفاء نقش ميکند (46،51،55). هنگامي که APP از مسير ترشحي70 عبور ميکند دچار يکسري شکستهاي پروتئوليتيکي71 ديگر ميشود که اين اعمال توسط انواعي از پروتئاز ها صورت ميپذيرد که به مجموع آنها سکرتازهاي آلفا و گاما اطلاق ميشود (56). در ابتدا APP توسط بتا سکرتاز شکسته ميشود و سبب توليد يک قطعهي اکتودوميني به نام SAPP? و يک قطعه C- ترمينا ل ميشود که اين قطعه C- ترمينال داراي تمام تواليA ? ميباشد . شکستهاي بعدي توسط سکرتاز يبب توليد آميلوئيد بتا ميشود. در عوض شکسته شدن APP توسط آلفا سکرتاز سبب توليد يک قطعهي اکتو دوميني ترشحي بلند به نام ?PPA و يک قطعه C- ترمينال لنگر شده به غشاء ميشود که ادامه شکست بخش C- ترمينال توسط گاما سکرتاز سبب توليد P3 ميشود. ژن APP داراي 17 اگزون ميباشد که از ميان آنها اگزونهاي 7، 8، 15 به صورت متناوب پردازش ميشوند ( 46، 48، 51،54).
بخش پروتئيني اصلي آميلوئيد بتا که در مغز بيمار آلزايمري رسوب ميدهد يک پروتئين چهار کيلو دالتوني ميباشد که آميلوئيد بتا72 ناميده مي شود )46 ،48،55،56).
پرسينيلينها يک خانواده از پروتئينهاي حفاظت شده از نظر تکاملي ميباشند که به صورت همه جايي بيان ميشود و داراي چند ين دومين غشاء گذر ميباشند (46،48 ،54 ،55 ،56). ژنهاي کدکننده پروتئينهاي پرسينيلين 1 را PS1 و PS2 مينامند. که به ترتيب بر روي کروموزومهاي 14 و 1 قرار دارند. تعداد موتاسيونهاي شناسايي شده در Presenilin 1 از تعداد موتاسيونهاي شناسايي شده در2 Presenilin خيلي بيشتر ميباشد (54،55).
PS2 توسط ژني 12 اگزوني که طولي برابر 23737 جفت باز دارد، کد ميشود و بر روي بازوي بلند کروموزوم شماره 1 در موقعيت 1q42 قرار گرفته است که از ميان دوازده اگزون تنها ده اگزون در سنتز پروتئين شرکت ميکنند و دو اگزون ابتدايي داراي اطلاعات غير کد کننده ميباشند. بيان ps2 در مفز پايين ميباشد ولي در ماهيچه اسکلتي ،قلب و پانکراس نسبتا بالا ميباشد ( 46،54 ،55، 56). PS1 در موقعيت 14q24.3 و PS2 در موقعيت 1q42.1 قرار گرفته است (56).
ايزوفرم 695 آمينو اسيدي در نورونها بيش از سلولهاي غير نوروني بيان ميشود. پروتئين ?APP دچار شکستهاي پروتئوليتيک دروني گوناگوني ميشود که از اين نوع شکستها را آنزيمي به نام آلفا سکرتاز کاتاليز ميکند و سبب آزاد شدن بخش خارج سلولي پروتئين ?APP ميشود که اين شکست آنزيمي در دومين بتا آميلوئيد ي رخ ميدهد و لذا يک مسير غير آميلوئيدساز73 طي ميشود و از توليد آميلوئيد بتا جلوگيري ميشود. در نوعي ديگر از شکستهاي پروتئوليتيک مربوط به پروتئين ?APP دو آنزيم به نامهاي بتا و گاما سکرتاز شرکت ميکنند که يبب توليد مجموعهاي از پپتيد هاي 42-40 اسيد آمينهاي از آميلوئيد بتا ميشوند. پپتيدهاي بتا آميلوئيدي که طول آنها 42 اسيد آمينه ميباشد در مقايسه با آميلوئيد بتاي 40 اسيد آمينهاي از ميزان سميت بيشتري براي نورونها بر خوردار ميباشند (46 ،48 ،51).اگر چه اعتقاد بر اين است42 ?A در سنتز آميلوئيد نقش بيشتري را عهده دار ميباشد ولي40 ? نقش مهمي در بلوغ پلاکهاي مرکزي ضخيم ايفا، ميکند بدون اينکه مستقيما توسعه بيماري را تحت تاثير قرار دهد (26). تا کنون 16موتاسيون مختلف از نوع missenese ، در ژن APP شناسايي شده است که برخي از موتاسيونها در ناحيه برش سکرتازها (سبب افزايش توليد بتا آميلوئيدي) اتفاقي ميافتد که تنها 3-2%موارد اتوزمال غالب از بيماري را شامل ميشود (43 ، 49 ،56). پس از ژن APP ،طي مطالعات آناليز پيوستگي، دو ژن ديگر به نامهاي پرسينلين1 (1PSEN) روي بازوي بلند کروموزوم 14 و پرسينلين 2 (PSEN2) روي کروموزم 1، به عنوان ژنهاي دخيل در آلزايمر زودرس شناسايي شدند که موتاسيون در اين ژنها با تغييردر برش باعث افزايش ?A42 مي شود و علاوه بر آن PSEN ها در برش درون غشايي برخي پروتئينهاي غشاء گذر مانند پروتئينهاي خانواده Notch لازم مي باشد ( 46،48 ، 51 ، 55 ،57) .133 جهش در ژن 1PSEN شناسايي شده که افراد داراي اين جهشها ،در دهه پنجم، چهارم و حتي سوم زندگي خود، بيماري را بروز دادهاند و در واقع ژن PSEN1 ،اصلي ترين عامل آلزايمر زودرس محسوب ميشود (57). PSEN1در بافتهاي گوناگون از بافتهاي عصبي مرکزي گرفته تا بافتهاي غير عصبي در سطح پاييني بيان ميشود PSEN همانند ?APP داراي پردازش متناوب ميباشد (46،48،51). تمام موتاسيونهاي روي داده در سه ژن ?APP،PSEN1 و PSEN2 در مجموع حدود 1% از کل موارد بيماري آلزايمر را به خود اختصاص ميدهند (1).
علاوه بر ژنهاي ذکر شده ژنهاي ديگري مثل آلفا -يک آنتي -کيمو تريپسين 74و رسپتور VDRL75 با آلزايمر خانوادگي در ارتباط ميباشند (46،48، 51 ،55).
پرسينيلينها پروتئينهايي غشاء گذر هستند که 9 بار عرض غشاء را طي ميکنند و بخش کاتاليتيکي اصلي کمپلکس آنزيمي گاما -سکرتاز ميسازد که اين کمپلکس آنزيمي در شکستن رسپتورهاي غشاء گذر تيپ 1 از جمله APP و Wnt ايفاء نقش ميکنند. افزايش APP شکسته شده توسط آنزيمهاي بتا و گاما سکرتاز باعث توليد پپتيدهاي A? 42 ? 40مي شود که موتاسيونهاي APP عامل ايجادFAD ،در نزديکي جايگاههاي شکست بتا و گاما سکرتاز قرار گرفتهاند و عموما بيماري



قیمت: تومان


پاسخ دهید