دانشگاه آزاد اسلامي
واحد ورامين – پيشوا
پايان نامه کارشناسي ارشد رشته مهندسي کشاورزي – علوم دامي(M.Sc)
گرايش فيزيولوژي
موضوع:
مقايسه اثرات سطوح مختلف لسيتين سويا و زرده تخم مرغ در محيط انجماد بر كيفيت اسپرم قوچ افشاري در داخل فصل توليدمثل
استاد راهنما:
دکتر حسن صادقي پناه
استاد مشاور:
دکتر کاظم کريمي
نگارنده:
محمدرضا ميرزا طبيبي
سال تحصيلي1393-1392
با تشكر از
تمامي چراغ افروزان راه علم و دانش، تمامي آنانكه تا اين لحظه،
‌شمعي پيش پايم روشن كرده اند.
آنهايي كه در تمامي اين سالها در خدمتشان بوده ام، بالاخص اساتيد بزرگوار و محترم
جناب آقايان دکتر کاظم کريمي و دکتر حسن صادقي پناه كه از آنان بسيار آموخته ام.

تقديم به
مادرم، درياي بي کران فداکاري و عشق که وجودم برايش همه رنج بود و
وجودش برايم همه مهر
و همسرم
که در سايه همياري و همدلي او به اين منظور نائل شدم
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکيده1
فصـل اول: کـليات
1-1- پرورش گوسفند3
1-2- حفظ انجماد مني3
1-3- هدف آزمايش8
1-4-پرسش اصلي تحقيق (مساله تحقيق)9
فصل دوم: پيشينه تحقيق
2-1- حفظ انجمادي11
2-1-1- کاربرد و فوايد حفظ انجمادي مني11
2-1-2- انواع روشهاي حفظ انجمادي12
2-1-3- تاريخچه حفظ انجماد مني قوچ 12
2-1-4- مراحل حفظ انجمادي مني14
2-2- عوامل موثر بر انجماد اسپرم قوچ15
2-2-1- رقيق کننده ها15
2-2-3- مواد نگهدارنده يا محافظت کنندهها16
2-2-3-1- مواد نگهدارنده درون سلولي يا نفود کننده16
2-2-3-2- مواد نگهدارنده برون سلولي يا نفود ناپذير18
2-3-آشنايي اختصاري با سيستم آناليز رايانه اي (CASA)27
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- تجهيزات مورد نياز براي جمع آوري، انجماد، ذوب و ذخيره مني و ارزيابيهاي اسپرم31
3- 2-آزمايش اول31
3-3- آزمايش دوم31
3-4- حيوانات و جمع آوري مني32
3-5- آماده سازي رقيق کنندهها32
3-6- رقيق سازي، انجماد و ذوب مني33
3-7- ارزيابيهاي کيفيت اسپرم بعد از فرآيند انجماد-ذوب33
3-8- آناليز آماري35
فصل چهارم: نتـايج
4-1- نتايج38
فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري
5-1- بحث44
5- 2- نتيجه گيري52
5-3- پيشنهادها 54
منابع55
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 3-1-تجهيزات مورد نياز براي جمع آوري، انجماد، ذوب و ذخيره مني و ارزيابيهاي اسپرم31
جدول4-1-2- صفات ارزيابي شده رقيق کننده حاوي سطوح مختلف لسيتين اسپرم قوچ افشاري پس از انجماد 38
جدول4-1-3- صفات ارزيابي شده رقيق کننده حاوي سطوح مختلف زرده تخم مرغ اسپرم قوچ افشاري پس از انجماد 39
جدول4-1-4- مقايسه ويژگي هاي حرکتي(مربوط به CASA) اسپرم قوچ افشاري در بين تيمارهاي اختصاص يافته 41
جدول4-1-5- صفات ارزيابي شده رقيق کنندههاي حاوي سطوح مختلف لسيتين و زرده تخم مرغ اسپرم قوچ افشاري پس از انجماد 42
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 4-1-1 مقايسه سطوح مختلف لسيستين اسپرم قوچ افشاري پس از انجماد39
نمودار 4-1-2 مقايسه سطوح مختلف زرده تخم مرغ اسپرم قوچ افشاري پس از انجماد40
چکيده
فرايند انجماد و ذوب اسپرم شامل در معرض قرار گرفتن ابتدايي اسپرم با مواد محافظ انجمادي، کاهشدما به زيرصفر درجه سلسيوس، ذخيره، ذوب و سرانجام حذف ماده محافظ انجمادي و بازگشت به حالت طبيعي است. اين تغييرات باعث آسيبهاي ساختاري و بيوشيميايي به اسپرم ميشود که ميتواند زندهماني و باروري اسپرم را تحت تاثيرقرار دهد. هدف از اين پژوهش، بررسي اثر سطوح مختلف لسيتين(5/0، 1، 5/1 و 2 %) و زرده تخم مرغ(10، 15، 17 و 20 %) در رقيقکننده پايه تريس- فروکتوز (همراه با 5 درصد گليسرول) پسازفرآيند انجمادو يخ‌‌گشايي بود. نمونه‌هاي مني توسط واژن مصنوعي از 4 راس قوچ افشاري بالغ، هفتهاي 2 بار جمعآوري شد. نمونههاي مني رقيق شده در معرض بخار ازت منجمد و در تانک حاوي ازت مايع ذخيره شد و سپس يخگشايي پايوتهاي حاوي اسپرم در آب گرم 37 درجه سلسيوس انجام شد. تحرککلوتحرک پيشرونده اسپرم با کمک سامانه آناليز رايانه‌اي اسپرم اندازهگيري شد. سلامت غشا، درصد اسپرمهاي زنده و مورفولوژي اسپرمها بعد از فرايند يخگشايي اندازهگيري شد. نتايج حاصل از اين آزمايش نشان داد که رقيق‌کننده حاوي 5/1% لسيتين و 15% زرده تخممرغ در مقايسه با ساير سطوحهاي آزمايشي موجب بهبود معنيدار در ميزان تحرک کل، تحرک پيشرونده، يکپارچگيغشا و اسپرمهايزنده شد (01/0p < ). سطوح مختلف لسيتين و زرده تخم مرغ اثر معنيداري روي مورفولوژي اسپرمها نداشتند (05/0p > ). مطابق با نتايج اين پژوهش به نظر مي‌رسد که افزودن 5/1% لسيتين و 15% زرده تخممرغ به رقيق‌کنندههاي انجماد اسپرم قوچ افشاري باعث بهبود معنيدار فراسنجههاي اسپرم از جمله تحرک و درصد اسپرمهاي زنده مي?شود.
کليد واژه ها : لسيتين، رقيق کننده، اسپرم منجمد، قوچ افشاري

فصـل اول
کـليات
1-1-پرورش گوسفند
پرورش گوسفند در ايران داراي قدمت تاريخي بسيار طولانيميباشد که هم اکنون ايران با داشتن 55 ميليون راس گوسفند، در رتبه چهارم جهان قرار دارد. اما متاسفانه به علت عدم بازده توليد مثلي و عدم استفاده از تلقيح مصنوعي در صنعت پرورش گوسفند، صرفه اقتصادي خوبي از اين صنعت به دست نيامده و رشد چنداني نکرده است. بنابراين اين مطالعه در مرحله اول به منظور انجماد مني قوچ با رقيق کنندههاي بر پايه منشا گياهي(لسيتين سويا) و حيواني(زرده) براي بهبود کيفيت مناسب اسپرم بعد از فرآيند انجماد-ذوب و در مرحله دوم به منظور ارزيابيعملکرد اين رقيق کنندهها با تست‌هايآزمايشگاهي مهممرتبط با توان باروري اسپرم صورت گرفت. نتيجه استفاده از اين تستها، انتخاب رقيق کننده مناسب براي انجماد مني قوچ براي استفاده در تلقيح مصنوعي و انجام آسان برنامههاي اصلاح نژادي و در نهايت گسترش پرورش گوسفند و اقتصادي بودن آن خواهد شد.
1-2- حفظ انجماد مني
حفظ انجماد مني و تلقيح مصنوعي فوايد زيادي را براي صنعت پرورش حيوانات اهلي، به ويژه براي بهبود توليد مثلي و ژنتيکيارائه ميکنند. اما بزرگترين مانع در حفظ انجماد مني، آسيبي است که به ساختمان اسپرم در طول فرآيند انجماد- ذوب وارد ميشود که منجر به باروري ضعيف اسپرم منجمد ميگردد (بارباس و همکاران، 2009). در طول سالهاي اخير، ابداع و توسعهي انواع رقيق کنندههاي مني جهت انجماد اسپرم و در نتيجه افزايش راندمان و موفقيت تلقيح مصنوعي گسترش زيادي پيدا کرده است. لذا محققين مطالعات گستردهاي براي توليد رقيق کنندههايي که بتوانند باعث حفظ انجمادي اسپرم شوند، انجام دادند. از مهمترين مزاياي منجمد کردن مني قوچ، ميتوان به بارور نمودن همزمان تعداد زيادي ميش با استفاده از اسپرم قوچهاي با نژاد برتر و چندقلوزا، انتقالآسان منياز مراکز توليد و جمعآوري به دورترين دامداريها، انجام زايشخارج از فصل توليد مثلي، جلوگيري از انقراض گونههاي در معرض خطر اشاره نمود (سالامون و مکسول، 2000).
در تحقيقات مرتبط با حفظ انجماد مني، بسياري از مطالعات بر تشخيص آسيبهاي وارد شده به اسپرم در طول فرآيند انجماد- ذوب تمرکز نمودهاند(تريمچ و همکاران، 1997: مديروس و همکاران، 2002). در حاليکه، مطالعات فراوان ديگري نيز به استفاده از محافظت کننده‌هاي مختلف در رقيق کننده مني براي جلوگيري يا کاهش اين آسيبها، براي بهبود کيفيت اسپرم بعد از فرآيند انجماد-ذوب تاکيد کرده‌اند(تساک ماکديس، 2010: فيزر و همکاران، 1984 ). بيشتر ارزيابيهاي آزمايشگاهي که براي سنجش کيفيت مني استفاده مي‌شود، همبستگي بالايي با توان باروري اسپرم ندارند. استفاده از رنگهاي فلورسنت با استفاده از ميکروسکوپ فلورسنت و دستگاه فلوسايتومتري، تجزيهو تحليل گستردهتري از پارامترهاي اسپرم مانند زنده ماني، يکپارچگيغشا و DNA، وضعيت آکروزوم، کروماتينوظرفيتدارشدن، عملکرد ميتوکندري و تغييرات ساختاري (آپوپتوزيس) اسپرم را فرآهم نموده است (گراهام، 2001).
در بحث رقيق کننده مني براي جلوگيري بهتر از آسيب انجمادي1 به کيفيت اسپرم، محافظت کنندههاي انجمادي2 مختلفي براي انجماد اسپرم در چند دهه گذشته استفاده شده است(کري و همکاران، 2000: واتسون، 1976). کيفيت اسپرم پس از ذوب، به دليل وقوع شوک سرمايي و تنش اسمزي در طي فرآيند انجماد- ذوب کاهش مييابد(سالامون و ويزر، 1972: بيلي و همکاران، 2000). بسياري از اين صدمات را مي توان با رقيق کننده مناسب و مواد محافظ انجمادي مانع شد(گيل و همکاران، 200). ترکيبات موجود در رقيق کنندهها بايد بتوانند اسپرم را نسبت به شرايط متغير بوجود آمده حفاظت نموده و حتي الامکان دچار صدمات کمتري کنند(هولت، 1997). غشاهاي سلولي در برابر آسيب ناشي از انجماد حساسيت بالايي دارند، به طوريكه طي فرايند سرد شدن تنشي بر غشا اعمال شده که اثرات زيان آوري را به دنبال خواهد داشت. در نتيجهي اين تغيير، سلول ممکن است سوراخ شده که منجر به مرگ آن مي‌شود(پاپا و مکاران، 2011). علاوه بر اين، اين تغيير ممکن است منجر به تجزيه ترکيبات سطحي غشا شود. بنابراين حفظ سلامت غشا براي توليد اسپرم با كيفيت، بعد از انجماد بسيار اهميت دارد(هولت و همکاران، 1992). رقيق کنندههاي مني داراي خواص ويژهاي هستند که موجب نگهداري طولاني تر اسپرمها ميشوند. اين مواد در تأمين انرژي مورد نياز، حفاظت اسپرم از آسيب‌هاي دمايي، کاهش استرسهاي فيزيکي و شيميايي ناشي از سرد کردن، انجماد-ذوب اسپرمها و در نهايت ايجاديک محيط مناسب براي زنده ماندن موقت اسپرمها نقش دارند(کري، 2000). گليسرول، دي متيل سولفوکسايد و اتيلن گليکول داراي وزن مولكولي كم بوده و عوامل محافظ انجمادي درون سلولي يا نفوذ کننده هستند و منابع ليپوپروتييني يا مواد با وزن مولکولي بالا مثل زرده تخم مرغ، شير يا لسيتين سويا براي جلوگيري از شوک سرمايي و گلوکز يا فروکتوز به عنوان منابع انرژي و ساير افزودنيها مانند آنزيمها و آنتي بيوتيکها به رقيق کننده اضافه ميشود(اماموردي و همکاران، 2013). منابع حيواني مانند زرده تخممرغ، يک جزء طبيعي از رقيق کنندههاي مني است که غشاي سلول اسپرم را در مقابل شوک سرمايي، در طول انجماد-ذوب محافظت ميکند(واتسون، 1981). مکانيسم محافظتي توسط فسفوليپيدها (لسيتين) و ليپوپروتئينهاي با چگالي پايين3 انجام ميگيرد(ويدسور و وايت، 1997: موکه و همکاران، 2008). مطالعات قبلي نشان داد که اسپرم قوچ ميتواند در برابر شوک سرمايي، با افزودن 15 درصد زرده تخم مرغ به رقيق کننده تريس محافظت شود(فيزر و همکاران، 1984). با اين حال، زرده تخم مرغ ممکن است آنتاگونيست مواد محافظ انجمادي، حاوي آلودگيهاي ميکروبي و خطر انتقال بيماريها، تغييرات زياد در ترکيبات آنها، دشواري مشاهدات ميکروسکوپي و سبب ظرفيت دار شدن اوليه اسپرم باشد. پروتئينهاي گياهي مانند لسيتين سويا4، فاقد اين ايرادات زرده تخم مرغ ميباشند.
در چند سال گذشته رقيقکنندههاي جديد حاوي لسيتينسويا براي جايگزيني زرده تخممرغ، به طور گسترده براي انجماد مني استفاده شده است(دل واله و همکاران، 2012: گيل و همکاران، 2003: فوکويي و همکاران، 2007). در نتيجه بهبود حفظ انجماد مني، به تشخيص آسيبهاي وارده به کيفيت اسپرم و استفاده از رقيق کننده مني مناسب براي جلوگيري از آسيبهاي انجمادي به اسپرم را در طي فرآيند انجماد-ذوب ميطلبد.
بنابراين، هدف پژوهش حاضر، بررسي استفاده از سطوح مختلف لسيتين سويا (5/0، 1، 5/1و 2%) و زرده تخم مرغ (10، 15، 17 و20 %) و مقايسه آنها و انتخاب بهترين سطوح آنها براي استفاده در رقيق کننده مني قوچ، ارزيابي اثر آن بر خصوصيات جنبايي، زنده ماني و يکپارچگي غشاي اسپرم قوچ در طي انجماد-ذوب ميباشد.در طول سالهاي اخير، پژوهشهاي بسياري روي بهبود حفظ انجمادي مني5 قوچ براي گسترش تلقيح مصنوعي صورت گرفته است. بقا و تحرك اسپرم پس از انجماد-ذوب تحت تاثير فاکتورهاي متعددي از قبيل كيفيت مني، نوع و غلظت اجزاي موجود در محيط انجماد مني از قبيل غلظت گليسرول و يا ساير مواد محافظ کننده مانند منابع پروتئيني و ليپوپروتئيني است. اين مواد در تأمين انرژي مورد نياز، حفاظت اسپرم از آسيبهاي دمايي، کاهش استرسهاي فيزيکي و شيميايي ناشي از سرد کردن و انجماد- ذوب اسپرمها و در نهايت ايجاد يک محيط مناسب براي حفظ کيفيت اسپرم نقش دارند. بنابراين استفاده از محيط انجماد مناسب مني قوچ که بتواند از اسپرمها در برابر آسيبهاي انجماد- ذوب محافظت کند و بقا و تحرک اسپرم را بعد از انجماد- ذوب حفظ کند، گام مهمي در جهت استفاده از اسپرم منجمد در تلقيح مصنوعي گوسفند و مطالعات آزمايشگاهي است.
فرآيند انجماد اسپرم اکثر پستانداران مستلزم گذراندن دو مرحله ميباشد. در مرحله اول که دوره خنک کردن6 ناميده ميشود، دماي مني رقيق شده از دماي 35-30 درجه به 5 درجه سلسيوس و در مرحله دوم که دوره منجمد کردن ميباشد، دماي مني رقيق شده از 5 درجه به 196- درجه سلسيوس در نيتروژن مايع کاهش داده ميشود. در مرحله اول براي مقابله با شوک سرمايي، رقيق كنندههاي سرمايي به مني اضافه ميگردد. اين رقيق كنندهها معمولا حاوي لسيتين، پروتئينها و ليپوپروتئينهاي زرده تخممرغ ميباشند. در ابتداي مرحله دوم كه مرحله انجماد است، به منظور حفاظت اسپرم در مقابل صدمات ناشي از تشکيل بلورهاي يخ، از رقيق كنندههاي انجمادي كه حاوي 7-3 درصد گليسرول است استفاده ميشود که موجب حفظ اسمولاريته شده و ظرفيت بافري رقيق کننده را تامين ميکند (ديپاز و همکاران، 2010: ويندسور و وايت، 1995). غشاهاي سلولي در برابر آسيب ناشي از انجماد داراي حساسيت بالايي ميباشند به طوري كه در طي فرآيند سرد شدن يک استرس حرارتي بر روي غشا ايجاد شده و منجر به تغيير کريستال مايع به فاز ژلي ميشود که در نتيجه اثرات زيان آوري را به دنبال خواهد داشت. در نتيجه اين تغيير، سلول ممکن است سوراخ شده و منجر به مرگ سلول شود. علاوه بر آن، اين تغيير ممکن است منجر به تجزيه ترکيبات سطحي غشا شود (هولت، 1984). بنابراين حفظ سلامت غشا براي توليد اسپرماتوزواهاي با كيفيت بعد از انجماد بسيار اهميت دارد. کشف خصوصيات حفاظتي گليسرول در حين انجماد اسپرم در سال 1949 ميلادي توسط پولژ باعث شد که بتواند براي اولين بار اسپرم حيوانات را منجمد کند. اينکه چگونه گليسرول باعث حفظ اسپرم در حين انجماد ميشود يک پديده کاملا شناخته شده است، چون هنوز هم در مورد مکانيسم عمل آن اختلاف نظر وجود دارد. گليسرول قابليت نفوذ پذيري بالايي داشته و اثر درون سلولي از خود نشان ميدهد. براي مثال اثر آبکشي شديد و بالاي گليسرول باعث کاهش تشکيل کريستالهاي يخ درون سلولي ميشود. مکانيسمي که گليسرول باعث آبکشي و کاهش دماي انجمادي ميشود به پتانسيل بالاي پيوند آبي آن مربوط ميشود که درنتيجه غلظت الکتروليتهاي آزاد شده افزايش يافته و ساخته شدن کريستالهاي يخ به تأخير افتاده و يا مقدار آن کاهش مي يابد که در نتيجه اسپرم در مقابل تغييرات فشار اسمزي و غلظتهاي نمک محافظت ميشود(مکلاگين و همکاران، 1992). علاوه بر گليسرول، دي متيل سولفوکسايد و اتيلنگلايکول هم استفاده ميشوند که داراي وزن مولكولي كم هستند و عوامل محافظ انجمادي درون سلولي يا نفوذ کننده7 ناميده ميشوند.
منابع ليپوپروتئيني يا مواد با وزن مولکولي بالا مثل زردهي تخم مرغ، شير يا لسيتينسويا براي جلوگيري از شوک سرما8 و گلوکز يا فروکتوز به عنوان منابع انرژي و ساير افزودنيها مانند آنزيمها و آنتي بيوتيکها به رقيق کننده اضافه ميشود(بلکشاو، 1995). براي تقويت رقيقكنندهها معمولا از تركيبات با منشا حيواني نظير زرده تخممرغ و شير كامل استفاده ميشود. اين رقيق کنندهها قادرند احتياجات مورد نياز اسپرم را که در بخشهاي قبلي ذکرشد، تامين کنند. زرده تخم مرغ نيز يک جزء معمول تشکيل دهنده محيطهاي انجماد است و با عمل بر روي غشا سلولي، اسپرم را در برابر شوک سرما محافظت ميکند، اما اين رقيق کنندهها مشکلاتي نيز با خود دارند به طوريکه درسالهاي اخير بحثهاي زيادي را به خود اختصاص دادهاند. يکي ازاين مشكلات، تغييرات زياد درترکيبات آنهاست به طوريکه استاندارد سازي هر يك از اجزاي وي‍ژه و مفيد موجود در آن رقيق كننده بر خصوصيات انجمادي اسپرم را با مشکل مواجه ميکند. علاوه بر اين زرده تخم مرغ و شير ممکن است حاوي آلودگيهاي ميکروبي باشند که با توليد سموم، ظرفيت باروري اسپرماتوزوا را شديدا کاهش داده و حتي باعث از بين رفتن آنها شوند و از همه مهمتر اينکه باعث انتقال بيماريهايي مثل آنفولانزاي مرغي شوند. از ديگر مشکلات زردهي تخم مرغ وجود مواد مضر از قبيل پروژسترون است که سبب ظرفيت دار شدن زود هنگام9 اسپرم در طي انجماد ميشود. در محيط داراي زردهيتخم مرغ به علت وجود مواد اضافي، مشاهدات ميکروسکوپي اسپرم دشوار است. همچنين مواد موجود در زرده سبب مهار تنفس اسپرمها يا کاهش تحرک آنها ميشود و نيز سموم اندوتوکسين توليدي توسط آلودگيهاي موجود در زرده تخممرغ باعث کاهش باروري اسپرم ميشود. بنابراين آلودگيهاي مايکوپلاسمايي و باکتريايي موجود در منابع حيواني مورد استفاده در انجماد مني و گسترش منيهاي منجمد گونههاي مختلف در سطح جهان همواره نگراني گسترش بيما‌ري‌هايي مانند جنون گاوي و آنفلوآنزاي مرغي را در سطح جهان در پي داشته است(ابوگلا و همکاران، 2004: اميرات و همکاران، 2004). فراواني منابع گياهي و عدم وجود آلودگي منابع گياهي اين ضرورت را ايجاد ميکند که اين منابع جايگزين منابع حيواني گردد، به طوريکه منابع گياهي به ويژه لسيتينسويا در مطالعات زيادي براي انجماد اسپرم گونههاي مختلف استفاده شده است که در فصل پيشينه تحقيق به طور کامل بررسي شده است.
1-3- هدف آزمايش
هدف پژوهش حاضر، بررسي استفاده از سطوح مختلف زرده تخم مرغ و لسيتين سويا در رقيق کننده دست ساز و انتخاب بهترين سطوح ليپوپروتئينهاي حيواني و گياهي در رقيق کننده مني قوچ، ارزيابي اثر آن بر خصوصيات جنبايي، زنده ماني و يکپارچگي غشاي اسپرم قوچ در طي انجماد- ذوب بود. لسيتين سويا10 به عنوان منبع گياهي و زرده تخممرغ به عنوان منبع حيواني در يک محيط پايه11 براي انجماد اسپرم قوچ در نظر گرفته شدند. بنابراين اهداف اين پژوهش شامل:
1- بررسي اثر غلظتهاي مختلف لسيتين سويا (5/0، 1، 5/1 و2%) روي جنبايي، زنده ماني، يکپارچگي غشاي پلاسمايي و مورفولوژي اسپرم بعد از فرآيند انجماد-ذوب
2- بررسي اثر غلظتهاي مختلف زرده تخم مرغ (10، 15، 17 و 20%) روي جنبايي، زنده ماني، يکپارچگي غشاي پلاسمايي و مورفولوژي اسپرم بعد از فرآيند انجماد-ذوب
3- توليد يک رقيق کننده دست ساز پايه و مطلوب براي انجام مطالعات بعدي انجماد مني
1-4-پرسش اصلي تحقيق (مساله تحقيق):
از بين دو نوع منبع لسيتين شامل زرده تخم مرغ و لسيتين سويا به عنوان محافظت کننده در برابر شوک سرما كدام يك از آنها و در چه سطحي جهت استفاده در محيط انجماد اسپرم قوچ افشاري در داخل فصل توليدمثل مناسب هستند؟
فصل دوم
پيشينه تحقيق
2-1- حفظ انجمادي
حفظ انجمادي12 اسپرم ابزار مفيدي براي مطالعات جنين شناسي آزمايشگاهي و تلقيح مصنوعي13 است و بخش اساسي و ضروري در فناوري هاي توليد مثل به حساب مي آيد. حفظ انجمادي به معناي ذخيره مواد بيولوژيک از جمله اسپرم در زير نقطه انجماد آب است، به گونهاي که اين مواد از بين نروند و جهت ذخيره طولاني مدت اسپرم براي لقاح آزمايشگاهي، مهندسي ژنتيک و تلقيح مصنوعي استفاده شود (ماتسوکا و همکاران، 2006).
2-1-1- کاربرد و فوايد حفظ انجمادي مني
حفظ انجمادي يک روش حفظ ژرم پلاسم14 است که در بخشهاي کشاورزي، آبزي پروري15، بيوتکنولوژي و حفظ گونههاي در معرض انقراض کاربرد دارد(اندرابي و همکاران، 2007). در بخش کشاورزي، حفظ انجمادي ژرم پلاسم براي بهبود ژنتيکي گونههاي اهلي، حفظ نژادهاي کمياب و مبادلات بين المللي ژرم پلاسم استفاده ميگردد. هم چنين حفظ انجمادي ژرم پلاسم، براي توليد و حفاظت از حيوانات تراريخته16 ضروري است و در بسياري از مطالعات پزشکي، به ويژه در زمينه ايمونولوژي، ويروسشناسي، نوروبيولوژي، سمشناسي و صنعت داروسازي کاربرد دارد. در مورد گونههاي در معرض انقراض، حفظ انجمادي مواد ژنتيکي براي برنامههاي مديريت ژنتيکي آن گونهها و ذخيره منابع ژنتيکي استفاده ميشود (هرارا و همکاران، 2006). در قوچ نشان داده شده است که مني منجمد ذخيره شده در طول 27 سال، باروري را تحت تاثير قرار نميدهد، که اين باعث حفظ منابع ژنتيکي نژادهاي بومي مي‌شود(سالامون و ويزر، 1972). امروزه، حفظ انجمادي مني کاربردهاي بيوتکنولوژيکي بسياري دارد، از آن جمله که ميتواند براي درمان مشکلات کم باروري17 انسان، بيماريهاي تهديدکننده حيات، حفظ مني و DNA گونههاي در خطر انقراض و حفظ تنوع زيستي18 مورد استفاده قرار گيرد.
2-1-2- انواع روشهاي حفظ انجمادي
دو روش ميتواند براي حفظ انجمادي گامت استفاده شود: انجماد آهسته و انجماد سريع19. انجماد آهسته با استفاده از غلظت کم محافظت کنندهها انجمادي همراه است که به سميت مواد شيميايي و شوک اسمزي مرتبط است. انجماد سريع يا ويتريفيکاسيون يک روش سريع که باعث کاهش شوک سرمايي ميشود، اما معمولا براي اسپرم انجام نمي‌شود، چون انتقال دما20 در سلولهاي اسپرم خيلي آهسته است که امکان انجام ويتريفيکاسيون را بدون اين که خطرات ناشي از اثرات محلول يا تشکيل بلورهاي يخ را براي اسپرم داشته باشد، بدهد(بارباس و همکاران، 2009). معمولا، حفظ انجمادي شامل کاهش درجه حرارت، از دست دادن آب سلولي21، انجماد و ذوب ميباشد(مک لاگين و همکاران، 1992). نرخ انجماد بايد به اندازه کافي آهسته باشد تا اجازه دهد آب از سلولها توسط روش اسمز خارج شود تا از تشکيل کرسيتالهاي يخ داخل سلولي که باعث صدمات برگشت ناپذير به سلولهاي اسپرم ميشود، جلوگيري شود.
2-1-3- تاريخچه حفظ انجماد مني قوچ
مطالعات بر روي تلقيح مصنوعي در گوسفند، در ابتداي قرن بيستم توسط ايوانف آغاز شد. اين مطالعات بر روي رقيق کنندهها و روشهاي رقيق سازي منجر به کاربرد آزمايشي تلقيح مصنوعي در گوسفند شد. بعد از جنگ جهاني اول مطالعات گسترده تري تحت رهبري ميلووانف آغاز شد و در اوايل سال 1930، تلقيح مصنوعي با استفاده از مني تازه و رقيق شده براي توليد انبوه گوسفندها با استفاده از مني قوچهاي با نژاد برتر، انجام شد. بارور نمودن همزمان تعداد زيادي ميش با استفاده از اسپرم قوچ هاي با نژاد برتر، نيازمند انتقال مني از مرکز توليد و جمع آوري به مزارع در فواصل دور است. همچنين امکان استفاده از اسپرم در زمانهاي مختلف سال، مشوق محققان براي ذخيره اسپرم در شرايط آزمايشگاهي شد. براي اين منظور بايد از روشهايياستفادهميشدکه با کاهش يا توقف متابوليسم، عمر باروري22 اسپرمها افزايش مي‌يافت(سالامون و مکسول، 2000). بر اين اساس محققين دو راه براي ذخيره اسپرم پيشنهاد نمودند:
اولين روش بر اساس نگهداري آنها در حالت مايع و کاهش دما به 10-5 و يا 15-10 درجه سلسيوس بود. در اين محدوده دمايي متابوليسم اسپرم به شکل برگشت پذيري متوقف ميشود. زماني که اسپرمها در دماي نزديک به صفر درجه سلسيوس نگهداري شوند، شوک سرمايي ميتواند تغييرات برگشت ناپذيري را در اسپرمها ايجاد کند و با افزودن ليپيدها به رقيق کننده و با سرد کردن تدريجي از دماي اتاق مي توان مانع ايجاد شوک سرمايي در اسپرم ها شد. نگهداري در حالت مايع تنها براي نگهداري و ذخيره کوتاه مدت امکان پذير بود. اين امر موجب شد تا محققين روش‌هاي مبتني بر کاهش دما به زير صفر درجه سلسيوس، که در آن اسپرم مدت زمان بيشتري نگهداري مي شود را جستجو کنند. مطالعات بر روي اثرات دماي زير صفر درجه سلسيوس بر روي زنده ماني اسپرم متعلق به شخصي به نام اسپالازاني مي باشد. وي ويال‌هاي23 حاول مني پستانداران را در برف قرار داد و بعد از ذوب آنها در دماي اتاق توانست که اسپرم‌هاي زنده را مشاهده نمايد. عدم وجود تجهيزات مناسب براي کاهش دما به زير 30- درجه سلسيوس محققان را مجبور ساخت تا آزمايشات خود را به دماهاي بالاتر از 30- درجه سلسيوس محدود کنند. از اين رو گزارش هاي متعدد اوليه اي مبني بر انجماد موفقيت آميز مني پستانداران در دماهاي 13-، 17- و 23- درجه سلسيوس وجود دارد. با شروع قرن بيستم و پيشرفت تجهيزات براي کاهش دما تا 200- درجه سلسيوس، تلاشهاي اوليه براي انجماد اسپرم در پستانداران در دماهاي خيلي پايين تر با شکست مواجه شد. ايوانف با انجماد اسپرم اسب در دماي 100- درجهسلسيوس هيچ اسپرم متحرکي را مشاهده ننمود. اين در حالي بود که در دماي 15- درجه سلسيوس انجماد اسپرم اسب با موفقيت انجام شده بود(سالامون و مکسول، 2000).
چند سال بعد گزارشهاي موفقيت آميزي از انجماد اسپرم انسان بر روي يخ خشک24 (70- درجه سلسيوس)، نيتروژن مايع (196- درجه سلسيوس) و هليوم25 مايع (296- درجه سلسيوس) منتشر شد. با ادامه موفقيت پژوهشگران در انجماد اسپرم پستانداران، مطالعات در زمينه بهينه سازي اين تکنيک انجام شد. ماکسيمف نشان داد که سوسپانسيون‌هاي سلولي از بافتهاي گياهي در يک محلول حاوي گليسرول قادرند از اسپرم در فرآيند انجماد- ذوب محافظت کنند (سالامون و مکسول، 1995). بررسيهاي کامل تر آزمايشگاهي نشان داد که محلول يک مولار گليسرول ميتواند محافظت خوبي را از اسپرم پستانداران (خرگوش، خوک، گاو، قوچ و اسب) در فرآيند انجماد-ذوب نشان دهد. گليسرول در سطح 18 درصد اثرات سمي بر روي اسپرم داشت(بيلفلد و همکاران، 1990). آزمايش مشهور پولژ و همکاران درسال 1949 منجر به کشف کامل خصوصيات حفاظتي گليسرول شد. کشف خصوصيات حفاظتي گليسرول پيشرفت عظيمي در تکنيک انجماد اسپرم بود. بعد از پي بردن به خاصيت محافظتي گليسرول، آزمايشهاي متعددي بعد از سال 1950 بر روي انجماد اسپرم قوچ با رقيق کنندههاي حاوي گليسرول انجام شد.
2-1-4- مراحل حفظ انجمادي مني
پنج مرحله براي حفظ انجمادي مني وجود دارد:
1- رقيق سازي و مواجه شدن با مواد محافظ انجمادي
2- سرد کردن تا دماهاي 5-4 درجه سلسيوس
3- قرار گرفتن در معرض بخار ازت و سپس ذخيره سازي در ازت
4- ذوب مجدد و قرار گرفتن در دماي اتاق
5- حذف مواد محافظ انجمادي
2-2- عوامل موثر بر انجماد اسپرم قوچ
حفظ انجمادي موفقيت آميز اسپرم تحت تاثير عوامل مختلفي است. از جمله اين عوامل مي توان به رقيق کننده، مواد محافظتي موجود در آنها، روش اضافه کردن اين مواد به رقيق کننده، نرخ سرد سازي و روش‌هاي ذوب اشاره نمود (اماموردي و همکاران، 2013). تلاشهاي قابل توجهي براي ايجاد روشهاي بهينه و ترکيب بهينهاي از اين عوامل جهت حفظ تحرک، سلامت و استحکام غشا بعد از انجماد-ذوب صورت گرفته است. هر کدام از اين عوامل با توجه به شرايط لازم براي دستيابي به بهترين نتيجه براي باروري اسپرم بعد از انجماد-ذوب دنبال ميشوند.
2-2-1- رقيق کننده ها
پلاسماي مني حاوي مقادير نسبتا بالايي از گليکوپروتئينها، گليکولپيدها و هورمونها ميباشد. اين مواد باعث محافظت از اسپرم بعد از انزال شده و انتقال اسپرم به دستگاه تناسلي ماده را تسهيل و باعث جلوگيري از ظرفيت يابي26 زود هنگام اسپرم مي شود. به هر حال پلاسماي مني تنها قادر است که به ميزان کمي از اسپرم در مقابل صدمات ناشي از سردسازي در فرآيند انجماد- ذوب محافظت نمايد. براي ذخيره سازي در دماهاي پايين نياز به رقيق کردن سيمن در رقيق کنندههاي خاص ميباشد. اين رقيق کنندهها بايد به طور کلي داراي اسيديته، ظرفيت بافرينگ27 و اسمولاريتي28 مناسبي باشند و بتوانند از اسپرم در مقابل صدمات ناشي از فرآيند انجماد-ذوب محافظت کنند(سالامون و مکسول، 2000). در ادامه به تعدادي از اين رقيق کننده ها که تاکنون مورد استفاده قرار گرفته اند به اختصار اشاره ميشود.
تريس (هيدروکسي متيل آمينومتان29) جزء اصلي رقيق کنندههاي امروزي براي انجماد مني گاو، قوچ و ساير گونهها ميباشد. اين بافر داراي ظرفيت بافرينگ و اسموتيک بسيار خوبي ميباشد و خاصيت سميت آن در مقايسه با ساير بافرها کمتر ميباشد. مطالعات متعدد نشان داده است که تريس به عنوان بهترين بافر براي رقيق سازي مني در اکثر گونههاي پستانداران عمل مي کند(سالامون و مکسول، 1995). بررسي مقايسهاي تريس به عنوان بافر رقيق کنندهها براي رقيق سازي و انجماد اسپرم قوچ نشان داد که بافر تريس در کنار گلوکز اثرات محافظتي بهتري نسبت به ساير قندها همچون فروکتوز، لاکتوز و رافينوز دارد(شانون و همکاران، 1995). البته تحقيقات بيشتر نشان داد که فروکتوز هم در کنار بافر تريس اثرات بهتري نسبت به ساير قندها دارد و اسپرم منجمد شده در رقيق کنندههاي بر پايه تريس، درصد بره زايي قابل قبولي را در مقايسه با ساير رقيق کنندهها نشان ميدهند.سالامون و همکاران نشان دادند که رقيق کنندههاي بر پايه تريس با 2% زرده تخم مرغ، جنبايي و کلاهک آکروزم اسپرم قوچ را پس از انجماد-ذوب تا حد قابل قبولي حفظ ميکند. بيشتر رقيق کنندههاي تجاري امروز که براي رقيق سازي مني گاو و گوسفند استفاده ميشود، بر پايه بافر تريس ميباشند.
2-2-3- مواد نگهدارنده يا محافظت کنندهها
2-2-3-1- مواد نگهدارنده درون سلولي يا نفود کننده
تمام روشهاي انجماد سلولي بر اساس استفاده از يک يا چند ماده محافظ انجماد است. لازمه يک محافظ انجمادي، بالا بودن قدرت نفوذ و سميت پايين30 آن ميباشد. گليسرول، دي متيل سولفوکسايد و اتيلن گليکول، عوامل محافظ انجمادي درون سلولي يا نفوذ کننده31 هستند، كه وزن مولکولي آنها نسبتا کم است. اين مواد از تجمع مولکولهاي آب با يکديگر براي تشکيل کريستالهاي يخ در درون اسپرم جلوگيري ميکنند و براي آبگيري آب داخل سلولي ضروري هستند. همچنين نقطه انجماد پايين آنها، زمان بيشتري براي آبگيري ايجاد ميکند. علاوه براين به عنوان حلال32، سبب حل شدن قندهاي غير قابل حل در محيط رقيق کننده ميشوند (عبدالحکيم و همکاران، 1991).
در طي فرآيند انجماد- ذوب، شوک سرمايي به شدت فسفولپيدهاي و گليکوپروتئينهاي موجود در سطح غشا را تحت تاثير قرار ميدهد و باعث شروع آسيبهاي ساختاري و بيوشيميايي ميشود. براي جلوگيري از اين آسيبها علاوه بر مواد محافظ درون سلولي، به مواد محافظ خارج سلولي يا نفوذ ناپذير نيز نيازمند است. اين مواد عمدتا ليپوپروتئينها و پروتئينهاي موجود در منابعي همچون زرده تخم مرغ، شير و منابع گياهي لسيتين سويا است. اين مواد با عمل بر روي غشاء سلولي، اسپرم را در برابر شوک سرما محافظت ميکند(سالامون و مکسول، 1995). استفاده از مواد محافظتي در غلظتهاي پايين ممکن است که براي حفاظت از اسپرم کافي نباشد و غلظت بالاي آنها نيز ممکن است که براي اسپرم سمي باشد. شرايط بهينه هر کدام از اين مواد محافظ براي دستيابي به بهترين باروي در ادامه دنبال ميشود. گليسرول معمول ترين ماده محافظ انجمادي است که قادر است به درون سلول نفوذ کند(سالامون و ويزر، 1972). کشف خصوصيات حفاظتي گليسرول توسط پولژ در سال 1949 تاثير بسيار عظيمي در تکنولوژي پيچيده انجماد اسپرم داشت. خاصيت حفاظتي گليسرول مربوط به توانايي برقراري پيوند آن با آب است و با افزايش حلاليت نمک در رقيق کنندهها باعث کاهش فشار اسمزي رقيق کننده مي‌شود. افزودن گليسرول به مني قبل از انجماد، شامل مرحله موازنه است كه در طي اين مرحله آب درون سلولي اسپرم بواسطه شيب اسمزي خارج شده و گليسرول جايگزين آن ميشود و بدين ترتيب مانع تشكيل كريستالهاي يخ درون سلولي شده و سلولها را در برابر آسيب حاصل از تشكيل كريستالهاي يخ محافظت ميکند.
علاوه بر گليسرول، چندين ماده محافظ درون سلولي ديگر نيز براي انجماد اسپرم پستانداران مورد بررسي قرار گرفته است. دي متيل سولفوکسايد وقتي که براي اولين بار به عنوان ماده جايگزين گليسرول مورد استفاده قرار گرفت، باعث کاهش تحرک و زنده ماني اسپرم بعد از انجماد- ذوب شد(هولت، 1994). با اين حال ترکيب 5/1 درصد دي متيل سولفوکسايد همراه با 7 درصد گليسرول در مقايسه با رقيق کننده حاوي تنها 5 درصد دي متيل سولفوکسايد بهتر بود(سالامون و مکسول، 1995). غلظت 2 درصد اتيلن گلايکول ميتواند از اسپرم در فرآيند انجماد- ذوب محافظت کند و اختلاف معني داري با رقيق کننده حاوي 5/3 درصد گليسرول از نظر تحرک و زنده ماني نشان نداد. در آزمايش ديگر حضور 5 درصداتيلن گلايکول در مقايسه با 5 درصد گليسرول در رقيق کننده سيمن قوچ باعث کاهش معني داري در زنده ماني اسپرم در گروه اتيلن گرديد. درصد بره زايي33 در ميشهاي تلقيح شده با اسپرم منجمد شده در رقيق کنندههاي حاوي 5/3 درصد گليسرول و 75/1 درصد اتيلن گلايکول اختلاف معني داري نشان نداد(سالامون و ويزر، 1972). در طول ساليان مختلف نگهدارندههاي متعددي براي رقيق سازي مني پستانداران مورد بررسي قرار گرفتهاند که هيچکدام از آنها نتوانستند همانند گليسرول عمل نمايند.
2-2-3-2- مواد نگهدارنده برون سلولي يا نفود ناپذير
زرده تخم مرغ
از سال 1939 وقتي که فيليپس و همکاران اثرات مثبت زرده تخم مرغ رابراي ذخيره سازي مني پستانداران کشف نمودند، زرده به عنوان يکي از اجزاي معمول در محيط انجماد اسپرم پستاندارن مورد استفاده قرار گرفت (فيليپس، 1939). زرده تخم مرغ، اسپرم را در برابر شوک سرمايي محافظت ميکند. زرده در سطح غشاي پلاسمايي سلول عمل ميکند و نقش آن بر خلاف گليسرول خارج سلولي است. علاوه بر اثرات مثبت زرده در طي فرآيند سرد سازي از دماي اتاق به دماي صفر درجه سلسيوس، در طي دوره انجماد نيز اسپرم از زرده براي محافظت از خود در برابر شوک سرمايي استفاده ميکند. جنبايي34، زنده ماني، سلامت آکروزوم و غشاي ميتوکندريايي اسپرم در طول استرسهاي فيزيکي و شيميايي ميتواند با حضور زرده در رقيق کننده تا حد قابل قبولي حفظ شود. زرده به عنوان يک بافر اسموتيک با حضور در رقيق کننده قادر است تحمل اسپرم را به هر دو نوع محيط هايپرتونيک و هايپوتونيک افزايش دهد. ثابت شده است که اثر محفاظتي زرده تخم مرغ براي اسپرم گاو بيشتر از قوچ است (سالامون و مکسول، 1995).
در مورد مکانيسم دقيق اثر زرده تخم مرغ اطلاعات دقيقي در دسترس نيست و فرضيههاي متنوعيدرباره اين اثر وجود دارد. ليپوپروتئينهاي با چگالي کم35 (LDL) بخش تاثير گذار زرده تخم مرغ است که با اتصال به غشاي اسپرم در طي فرآيند انجماد-ذوب، باعث مقاومت اسپرم در برابر آسيبهاي حرارتي مي‌شود(واتسون و همکاران، 1975). به هر حال نقش کامل پروتئينها و لپيدهاي موجود در LDL در برقراري پيوند و ارتباط با غشاي اسپرم هنوز به طورکامل مشخص نيست. همچنين LDL حاوي مقاديري فسفاتيديلکولين و فسفاتيدلسرين است که درطيفرآيند انجماد-ذوب به طور مرتب جايگزين فسفوليپدهاي از دست رفته غشاي اسپرم ميشوند(گيلان و همکاران، 2005). فسفولپيدها ميتوانند يک لايه محافظتي در اطراف غشاي اسپرم تشکيل دهند. اين پرده محافظتي در زمان شکسته شدن مولکولهاي LDL به وجود ميآيد(ولنته و همکاران، 2010). جذب و ژلاتينه شدن آپوپروتئينهاي36 LDL در اطراف غشاي اسپرم باعث تشکيل يک غشاي محافظتي در مقابل کريستالهاي يخ در اطراف غشاي اسپرم شود. فرضيهاي ديگر در اين مورد اين است که ليپوپروتئينهاي با چگالي کم با پپتيدهاي کاتتيونيک37 موجود در پلاسماي مني براي اتصال به غشاي اسپرم رقابت ميکند. اين پپتيدها که وزن مولکولي کمتر از 5 کيلو دالتون دارند، ميتوانند با اتصال به غشاي اسپرم باعث خارج شدن کلسترول از سطح غشا شوند(موکه و همکاران، 2008).
غلظتهاي مختلفي از زرده تخم مرغ دررقيق کنندهها براي انجماد اسپرم قوچ مورد بررسي قرارگرفته است. غلظتهاي 3 تا 50 درصد زرده براي رقيق سازي مني قوچ در آزمايشهاي مختلف نتايج متفاوتي داشته است. امروزه به طور کلي از غلظتهاي 15 تا 20 درصد زرده تخم مرغ در رقيق کنندهها براي رقيق سازي مني قوچ استفاده ميشود. ريتار و همکاران در آزمايشي نشان داند که درصد بره زايي در ميشهاي تلقيح شده با اسپرمهاي منجمد شده دررقيق کننده حاوي 3/1 و 12 درصد زرده مشابه است(روبايو و همکاران، 208). به هر حال غلظت اپتيمم زرده در رقيق کننده مني قوچ بستگي به اجزاء تشکيل دهنده رقيق کننده دارد. گرچه زرده تخم مرغ را بعضي مواقع مي توان با ماده ديگري با فعاليت مناسب جايگزين نمود، با اين حال در مورد انجماد مني قوچ، زرده به واسطه خاصيت محافظتي بر روي غشاي سلولي، يکي از اجزاي مهم محيط انجماد است. فروزانفر و همکاران در سال 2010 نشان دادند غلضت زرده تخم مرغ تا ميزان 20 درصد و غلظت گليسرول تا ميزان 7 درصد حجم کلي محيط انجماد، اثرات مثبتي بر روي توان حرکت اسپرم قوچ نژاد لري بختياري پس از انجماد- ذوب دارد. با وجود اثرات بسيار مثبت زرده تخم مرغ براي رقيق سازي مني در تمامي گونه هاي پستانداران، در سالهاي اخير استفاده از آن با مشکلاتي روبرو شده است و تلاشهايي در جهت حذف و يا کاهش مقدار آن در رقيق کنندهها صورت گرفته است.
الف- اثرات منفي زرده تخم مرغ
با وجود اثرات بسيار مثبت زرده تخم مرغ براي محافظت از اسپرم، در سالهاي اخير پژوهشگران به دنبال راهکاري براي حذف، استخراج بخش موثر و يا کاهش مقدار زرده تخم مرغ در رقيق کنندههاي مني پستانداران هستند. مهمترين بخش موجود در زرده تخم مرغ، ليپوپروتئينهاي با چگالي کم هستند. مقدار اين ليپوپروتئينها در زرده تخم مرغ ميتواند متغير باشد و عواملي همچون وراثت، تغذيه، تعداد روزهاي تخمگذاري مرغ و شرايط نگهداري تخم مرغ، مقدار آنها را تحت تاثير قرار بدهد. اين امر سبب شده است که تهيه غلظتهاي استانداردي از زرده تخم مرغ در رقيق کنندههاي انجماد مني با مشکل روبرو شود و رقيق کنندههايحاوي زرده تخم مرغ به عنوان يک رقيق کننده غير استاندارد شناخته شوند(موکه و همکاران، 2008). بالارفتن غلظت زرده تخم مرغ در رقيق کننده اگر چه باعث افزايش درصد اسپرمهاي زنده و متحرک ميشود، ولي درصد اسپرمهاي با آکروزوم سالم را کاهش ميدهد. ناحيه آکروزم در اسپرم، مهمترين بخش شرکت کننده اسپرم در لقاح38 است. بنابراين اسپرمهايي که ناحيه آکروزم آنها آسيب ديده است، به عنوان اسپرمهاي غير بارور تلقي ميشوند. کاهش سلامت آکروزم در اسپرم در اثر افزايش غلظت زرده تخم مرغ در گونههاي بز، قوچ و بوفالو گزارش شده است(اميرات و همکاران، 2004).
همچنين زرده تخم مرغ به طور طبيعي حاوي آلودگيهايي است که ميتواند از طريق رقيق کنندههاي مني باعث انتفال آن به صورت درون گونهاي و بين گونهاي شود. اين آلودگيها نه تنها به مناطق اطراف منتفل مي شوند، بلکه از طريق صادرات اسپرم به کشورهاي ديگر هم قابل انتقال هستند و ميتوانند باعث شيوع انواع بيماريها شوند (ايرس و همکاران، 2003). بوسهآ گزارش که اين آلودگيها علاوه براين که ميتواند باعث انتقال يک بيماري شود، ميکروارگانيسمهاي موجود با توليد سمومي ميتواند روي اسپرمها تاثير گذاشته و باعث مرگ آنها شود. موسا و همکاران در سال 2002 نشان دادند که حضور يک سري مواد در زرده تخم مرغ که ميتواند باعث جلوگيري از تنفس اسپرم شود، جنبايي و زنده ماني اسپرم را کاهش مي‌دهد. اين امر سبب شده است که تقاضا براي جايگزين کردن زرده با بخش موثر آن يا ديگر مواد جايگزين افزايش يابد که در ادامه به آن اشاره شده است.
ب: استخراج شيميايي بخش موثر زرده تخم مرغ
پژوهشهاي بسياري براي يافتن بخش موثر زرده تخم مرغ با هدف جداسازي و استخراج آن انجام شده است(اميرات و همکاران، 2004). پک39 و همکاران زرده تخم مرغ را با استفاده از اولتراسانتريفيوژ40 خالص سازي کردند و مشاهده نمودند که ليپوپروتئينهاي با چگالي کم داري اثر محفاظتي بر روي غشاي اسپرم ميباشد(پکه و همکاران، 1974) بسياري از محققين اين واقعيت را که ليپوپروتئينهاي با چگالي کم داراي عملکرد محافظتي بر روي غشاي اسپرم در طي فرآيند انجماد- ذوب ميباشد، تاييد کردهاند. ليپوپروتئين‌هاي با چگالي کم به خصوص بخشهاي فسفولپيدي قادر هستند که با اتصال به غشاي اسپرم، آسيب به فسفولپيدهاي غشا را در طي شوک سرمايي به تاخير انداخته و در نتيجه باعث افزايش مقاومت آنها در برابر اين شوک ميشوند. به هر حال نقش دقيق پروتئينها و لپيدهاي موجود در LDL در برقراري پيوند و ارتباط با



قیمت: تومان


پاسخ دهید