دانشکده علوم پايه دامغان
گروه زيست‌شناسي
پايان‌نامه
جهت دريافت درجه کارشناسي ارشد در رشته زيست‌شناسي ژنتيک (آزاد)
عنوان
کلونينگ و بيان فاکتور محرک رشد کلني گرانولوسيتي(GCSF) نوترکيب
در مخمر Hansenula Polymorpha
استاد راهنما:
دکتر يگانه طالب خان گروسي
استاد مشاور:
دکتر رضا نظام زاده
دانشجو:
آرمين سميع
پاييز 1393
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول مقدمه
ميکروبيولوژي هانسونلا پلي مورفا………………………………………………………………………………………..1
مطالعات ژنتيکي…………………………………………………………………………………………………………………2
جهش در ژنهاي کد کننده آنزيم هاي پراکسي زومي يا سيتوپلاسمي درگير در متابوليسم متانول……….4
نقشه ژنتيکي………………………………………………………………………………………………………………………5
توليد مثل واسپورزايي………………………………………………………………………………………………………….6
اسپورزايي…………………………………………………………………………………………………………………………6
پروموتورهاي مورد استفاده در سيستم بياني هانسونلا پلي مورفا RB11………………………………………..7
HARS1…………………………………………………………………………………………………………………………..8
بيان همزمان……………………………………………………………………………………………………………………….9
ترشح پروتئين هاي هترولوگ اليگومري و فعال……………………………………………………………………..10
توليد واکسن نوترکيب……………………………………………………………………………………………………….10
مخمرها به عنوان ميکروارگانيسم هاي توليدي………………………………………………………………………..11
ساخت سويه هانسونلا پلي مورفا بيان کننده آنتي ژن HBS………………………………………………………11
توليد کاست بياني و وکتور پلاسميدي………………………………………………………………………………….11
انتقال وکتورهاي بياني به هانسونلا پلي مورفا…………………………………………………………………………12
جداسازي سويه هاي نوترکيب…………………………………………………………………………………………….12
تنظيم متابوليسم متانول……………………………………………………………………………………………………….12
فاکتور محرک رشد کلني (G-CSF)…………………………………………………………………………………….13
ژن gcsf………………………………………………………………………………………………………………………….13
پروتئين GCSF………………………………………………………………………………………………………………..13
عملکرد پروتئين GCSF…………………………………………………………………………………………………….14
فصل دوم مواد و روش ها
ميکروارگانيسم هاي مورد استفاده………………………………………………………………………………………..17
محيط هاي کشت مورد نياز………………………………………………………………………………………………..17
پلاسميدهاي مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………..18
آنزيم ها و کيت ها……………………………………………………………………………………………………………18
آنتي بيوتيک ها…………………………………………………………………………………………………………………18
الکتروفورز افقي محصول PCR و يا نمونه DNA بر روي ژل آگارز………………………………………….19
تخليص محصول هضم آنزيمي با استفاده از کيت تخليص از ژل آگارز……………………………………..19
واکنش ليگاسيون قطعات تخليص شده…………………………………………………………………………………20
تهيه سلول هاي مستعد ‘E. coli TOP10F به روش تيمار با کلريد کلسيم…………………………………..20
انتقال پلاسميد به سلول هاي مستعد……………………………………………………………………………………..21
بررسي کلونهاي نوترکيب به روش سريع………………………………………………………………………………21
PCR بر روي کلني هاي باکتريايي/مخمري…………………………………………………………………………..22
استخراج پلاسميد در مقياس کم………………………………………………………………………………………….22
استخراج پلاسميد در مقياس زياد………………………………………………………………………………………..23
الکتروفورز پروتئين بر روي ژل پلي اکريل آميد(SDS-PAGE)………………………………………………..24
سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..29
PCR اختصاصي بر روي ژن gcsf……………………………………………………………………………………….30
کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بياني هانسونلا………………………………………………………………………31
هضم آنزيمي وکتور pGH-gcsf………………………………………………………………………………………….32
هضم آنزيمي وکتوربياني pHan…………………………………………………………………………………………33
کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بياني pHan………………………………………………………………………33
بررسي کلون هاي نوترکيب pHan-gcsf……………………………………………………………………………….34
هضم آنزيمي وکتور pHan-gcsf…………………………………………………………………………………………35
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسين در وکتور بياني pHan-gcsf……………………………………………..35
PCR اختصاصي بر روي ژن مقاومت به زئوسين……………………………………………………………………35
کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونينگ pGEM-T Easy………………………………………………….37
بررسي کلون هاي نوترکيب pGEM-zeo……………………………………………………………………………..38
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسين در وکتور بياني pHan-gcsf………………………………………………39
هضم آنزيمي وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo……………………………………………………………………39
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسين در وکتور بياني تيمار شده با آلکالين فسفاتاز pHan-gcsf………40
بررسي کلونهاي نوترکيب pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41
انتقال پلاسميد نوترکيب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلي مورفا…………………………………41
هضم آنزيمي وکتور بياني pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41
الکتروپوريشن سلول هاي هانسونلا پلي مورفا………………………………………………………………………..42
تأييد کلونهاي نوترکيب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصي ژن زئوسين………………………..43
بيان پروتئينGCSF در هانسونلا پلي مورفا…………………………………………………………………………..44
کشت سلولهاي مخمري……………………………………………………………………………………………………..44
بررسي بيان پروتئين نوترکيب با روش SDS-PAGE………………………………………………………………44
تزريق نمونه پروتئيني به خرگوش………………………………………………………………………………………..45
ايمونوبلاتينگ…………………………………………………………………………………………………………………..46
فصل سوم نتايج
سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..49
PCR اختصاصي بر روي ژن gcsf………………………………………………………………………………………49
طراحي پرايمر هاي اختصاصي ژن gcsf……………………………………………………………………………….49
بهينه سازي واکنش PCR براي ژن gcsf……………………………………………………………………………….50
کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بياني هانسونلا………………………………………………………………………51
هضم آنزيمي وکتور کلونينگ pGH-gcsf و وکتور بياني pHan……………………………………………….51
بررسي کلونهاي نوترکيب pHan-gcsf…………………………………………………………………………………52
بررسي کلونها به روش سريع……………………………………………………………………………………………..52
انجام PCR ژن gcsf بر روي پلاسميد نوترکيب pHan-gcsf……………………………………………………52
هضم آنزيمي وکتور تأييد شده pHan-gcsf…………………………………………………………………………..53
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسين در وکتور بياني pHan-gcsf……………………………………………..54
PCR اختصاصي بر روي ژن مقاومت به زئوسين (Sh ble)…………………………………………………….54
کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونينگ pGEM-T Easy………………………………………………….55
تأييد کلون هاي نوترکيب pGEM-zeocin……………………………………………………………………………55
بررسي سريع کلونهاي نوترکيب…………………………………………………………………………………………..55
هضم آنزيمي پلاسميد نوترکيب pGEM-zeo با BglII……………………………………………………………56
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسين در وکتور بياني pHan-gcsf………………………………………………57
بررسي کلونهاي نوترکيب pHan-gcsf-zeocin……………………………………………………………………57
بررسي سريع کلونهاي نوترکيب…………………………………………………………………………………………..57
بررسي کلونها به روش Colony-PCR…………………………………………………………………………………58
برش آنزيمي وکتور نوترکيب pHan-gcsf-zeo………………………………………………………………………58
انتقال پلاسميد نوترکيب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلي مورفا…………………………………59
هضم آنزيمي وکتور بياني pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا………………………………….59
تأييد کلونهاي نوترکيب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسين……………………………………….59
بيان پروتئينGCSF در هانسونلا پلي مورفا………………………………………………………………………….60
تأييد پروتئين نوترکيب توليد شده با روش Immuno-Blotting……………………………………………….61
فصل چهارم :بحث و پيشنهادات
رويکرد کلي پژوهش…………………………………………………………………………………………………………63
فصل پنجم : منابع و پيوست
فهرست منابع و مواخذ……………………………………………………………………………………………………….66
پيوست‌ها…………………………………………………………………………………………………………………………75
مقدمه
توليد پروتئين هاي نوترکيب يک بازار ميليارد دلاري دارا مي باشد. از طرف ديگر توليد يک محصول نوترکيب جديد با انتخاب يک ميزبان مناسب شروع مي شود. در ميان سيستم هاي بياني مختلف، سلولهاي مخمري به عنوان تک سلولي هاي توليد کننده با ويژگي دستکاري هاي ژنتيکي ساده و داشتن مسيرهاي ترشحي اختصاصي که در توليد پروتئين کامل و فعال و انتقال آن به خارج از سلول مؤثر مي باشند، يکي از بهترين انواع سيستم هاي شناخته شده مي باشند. ساکاروميسس سرويزيه، پيکيا پاستوريس و هانسونلا پلي مورفا در اکثر مطالعات به عنوان سلولهاي مخمري ميزباني مورد استفاده قرار گرفته اند که داراي مسير مشترک بيوشيميايي در متابوليسم متانول مي باشند. در حال حاضر تکنولوژي هانسونلا به دليل ميزان بيان بالا مورد توجه جهاني قرار گرفته است. از جمله اقلام دارويي توليد شده در اين سلولها ميتوان به واکسن هپاتيت B، انسولين و اينترفرون آلفا و بتا اشاره نمود.
هدف از اين مطالعه ، استفاده از وکتور بياني طراحي شده جهت بيان فاکتور رشد کلني گرانولوسيتي (GCSF) نوترکيب به عنوان پروتئين کانديد مي باشد.
مواد و روش ها
cDNA کد کننده ژن فاکتور محرک رشد کلوني گرانولوسيتي در وکتور بياني طراحي شده مربوط به هانسونلا پلي مورفا که شامل پروموتر، توالي سيگنال پپتيد، توالي خاتمه دهنده رونويسي و شاخص انتخابي اوکسوتروفي مي باشد کلون گرديد و بدين ترتيب وکتور بياني مورد نظر ساخته شد. هضم هاي آنزيمي به منظور تأييد قطعات کلون شده در وکتور بياني طراحي شده انجام شد. القاء بيان پروتئين نوترکيب در اين سيستم با متانول صورت گرفت و ايمونوبلاتينگ جهت تأييد پروتئين توليد شده نوترکيب صورت گرفت.
نتايج
ماهيت تواليهاي کلون شده در وکتور بياني از طريق هضم هاي آنزيمي با استفاده از سايتهاي طراحي شده در توالي سنتز شده و مشاهده قطعات مورد نظر در ژل آگارز ارزيابي شد. وکتور نوترکيب به فرم خطي با روش الکتروپوريشن به سلول مستعد هانسونلا پلي مورفا انتقال داده شد و القاء بيان پروتئين با متانول صورت پذيرفت. پروتئيني حدوداً 20 کيلو دالتوني بر روي ژل SDS-PAGE مشاهده گرديد که با ايمونوبلاتينگ پروتئين توليد شده به عنوان GCSF تأييد شد.
بحث
پروتئين توليد شده با روش بلاتينگ تأييد گرديد. در ادامه بايستي عملکرد اين پروتئين در واکنشهاي ايمونولوژيکي مورد بررسي قرار گيرد. از طرف ديگر عملکرد اين پروتئين در مقايسه با فرم توليد شده در E. coli مقايسه شود.
کليد واژه ها
هانسونلا پلي مورفا، فاکتور محرک رشد کلوني گرانولوسيتي (GCSF)، مهندسي ژنتيک
فصل اول : مقدمه
در طول چند دهه اخير به سه دليل زير مطالعات زيادي بر روي مخمر هانسونلا پلي مورفا صورت گرفته است:
1. رشد سريع اين مخمر با مصرف متانول به عنوان تنها منبع کربن و انرژي،
2. تحمل دماهاي بالا (توانايي رشد در دماي °C49)،
3. تبادل آسان محتواي ژنتيکي بين سلولهاي هاپلوئيد و ديپلوئيد ( (Teunisson, 1960.
1-1ميکروبيولوژي هانسونلا
اين مخمر براي اولين بار در سال 1951 از آب پرتقال حاوي 50% قند در فلوريداي آمريکا جداسازي شد.
سلولهاي هانسونلا به هر دو صورت سلولهاي ديپلوئيدي و هاپلوئيدي رشد مي کنند. کلني ها بر روي محيط کشت جامد داراي طيف رنگي صورتي هستند که به علت آسکوسپورها مي باشد. کلني سلولهاي هاپلوئيدي و ديپلوئيدي از نظر رنگ، اندازه، چيدمان سلولي و ساير ويژگيها با يکديگر متفاوت مي باشند.
تاکنون اطلاعاتي در مورد توانايي هانسونلا پلي مورفا در تشکيل ميسليوم کاذب پيدا نشده است (Teunisson, 1960; Wickerham, 1970).
شکل 1-1 مخمر H. polymorpha
هانسونلا پلي مورفا ميتواند در دماي بالا و در °C42 رشد کند. به نظر مي رسد در اين مخمر سنتز تره هالوز قسمتي از پاسخ به قحطي منبع کربن و شوک حرارتي است و پيشنهاد شده که اين ترکيب، فاکتور مهمي در مقاومت دمايي است (Reinders, 1999).
مطالعات انجام شده بر روي هانسونلا پلي مورفا به طور عمده به بررسي پروتئين هاي سلولي، ساختار سلولهاي مخمر در حال رشد و يا بررسي متابوليسم مخمر پرداخته اند.
در سويه هايي از اين مخمر که از متانول به عنوان منبع انرژي استفاده مي کنند، آنزيمهاي متانول اکسيداز و کاتالاز، به فرم کريستالي درون اندامکي به نام پراکسي زوم قرار گرفته اند (Van Dijken, 1975).
هانسونلا پلي مورفا بعنوان يک ارگانيسم متيلوتروف، يک مدل مطلوب براي تحقيق در مورد عملکرد پراکسي زم ها و تکامل حيات مي باشد. همچنين به منظور بررسي ژنتيکي جنبه هاي مختلف متابوليسم سلولي از جمله متابوليسم متانول، جذب نيترات و مقاومت به فلزات سنگين مورد مطالعه قرار مي گيرد ( (Mannazzu, 2000.
با وجود اين ويژگيها، هنوز قابليت هاي ژنتيکي و طبيعي سويه هاي مورد استفاده از اين مخمر کاملاً مشخص نيست و کنترل ژنتيکي فرايندهاي سلولي پايه از جمله کنترل تقسيم سلولي، توليد مثل و اسپورزايي هنوز با سؤالات زيادي مواجه مي باشد.
با اينحال هانسونلا پلي مورفا به عنوان يک ميزبان براي توليد پروتئين هاي خارجي(ترشحي به خارج از سلول) توجه زيادي را به خود جلب کرده است ( (Gellissen, 2000.
1-2مطالعات ژنتيکي
تحقيقات ژنتيکي تاکنون تنها بر روي سه سويه از اين مخمر انجام شده است که شامل سويه هاي DL-1، CBS 4732 و NCYC 495 مي باشند.
پيدايش سويه هاي هانسونلا پلي مورفا از سويه هاي جهش يافته اکسوتروف شروع شده است.اين موتانت ها از سويه هايي که در بالا نام برده شد با استفاده از ترکيب شيميايي N-متيل-N-نيترونيتروزو گوانيدين1 يا اتيل متان سولفونات به دنبال يک مرحله غني سازي با نيستاتين به دست آمده اند.
از طرف ديگر اشعه ماوراء بنفش نيز يک موتاژن بسيار قوي است که طيف موتانت هاي ايجاد شده بوسيله آن در مقايسه با موتانت هاي حاصل از مواد شيميايي متفاوت و گسترده تر مي باشد (Roggenkamp, 1986).
بطور کلي فرايندهاي جهش زايي متعددي در اين مخمر انجام شده است که يکي از اين فرايندها، جهش هاي ژنتيکي است که منجر به سنتز اسيدآمينه هاي آروماتيک مي شود که به مخمر اجازه رشد در محيط غني YPD را نمي دهند (Krappmann, 2000).
از جمله انواع جهش يافته هاي اکسوتروف ميتوان به موارد زير اشاره نمود:
1. سويه هانسونلا پلي مورفاي جهش يافته اي که براي رشد بر روي محيط هاي معدني الزاماً به ريبوفلاوين نياز دارد و محدود نمودن منبع ريبوفلاوين تأثير شديدي بر روي سنتز مجموعه الکل اکسيداز و تکثير پروکسي زومهاي سلولي دارد (Evers, 1994).
2. نوع دوم جهشهاي ايجاد شده در ژن FAD1 است که اسيد چرب دلتا2 را کد مي کند. کاربرد اين سلولهاي جهش يافته در بررسي ژنتيکي سنتز اسيدهاي چرب غيراشباع مي باشد ( (Anamnart, 1998.
تحقيقات اخير نشان داده است که هانسونلا پلي مورفا ميتواند براي بررسي مقاومت به فلزات سنگين مورد استفاده قرار گيرد چراکه توانايي رشد در حضور تجمع فلزات سنگين متفاوت را که براي ساير موجودات سمي است دارا مي باشد (Mannazzu, 1997).
در طي رشد در محيط حاوي vanadate، سلول ها افزايش قابل توجهي از پلي فسفات هاي واکوئلي پيدا ميکنند. احتمالاً نقش اين واکوئل ها در فعال کردن مکانيسم هاي اتوفاژي است که شايد براي جبران کمبود مواد مغذي و يا حذف ساختارهاي سلولي ناهنجار القاء شده توسط اين يون فلزي لازم باشند (Mannazzu, 1998).
سلول هاي هانسونلا پلي مورفا در مقايسه با S. cerevisiae به يون هاي کادميوم(cd2+) بسيار مقاومند )اين مقاومت به شدت به ماهيت منبع کربن استفاده شده بستگي دارد. سلول ها اغلب زمانيکه بر روي محيط حاوي گلوکز رشد ميکنند به کادميم مقاومتراند اما در طي رشد بر روي محيط حاوي متانول، به عنوان منبع کربن و انرژي، به اين يون بسيار حساس مي باشند. سويه هاي جهش يافته مقاوم به کادميوم به سه گروه cds1، cds2 و cds3 تقسيم ميشوند ( (Lahtchev, unpublished data.
جهش در ژنهاي کدکننده آنزيم هاي پراکسي زومي يا سيتوپلاسمي درگير در متابوليسم متانول
ژن AOX1 (MOX)، کدکننده آنزيم الکل اکسيداز (AO) موجود در ماتريکس پروکسي زوم است و يکي از بهترين ژن هاي هانسونلا پلي مورفا در تحقيقات مي باشد (Ledeboer, 1985). الکل اکسيداز يک آنزيم فلاووهومواکتامري است که اولين مرحله در متابوليسم متانول را کاتاليز ميکند. مونومر اين آنزيم در سيتوپلاسم سنتز شده و به صورت هومواکتامر فعال، تجمع يافته و در داخل پراکسي زوم قرار ميگيرد. حدود 210 نوع جهش يافته از ژن AO وجود دارد ( (Titorenko, 1995. بيان اين ژن در مرحله رونويسي تنظيم ميشود.
شکل 1-2 مورفولوژي سلولهاي H. polymorpha جهش يافته
در هانسونلا پلي مورفا وقايع مربوط به مهار و القاء ژنهاي کد کننده آنزيم هاي اختصاصي متانول و يا آنزيمهاي پراکسي زومي به شدت کنترل مي شوند. تنظيم در سطح رونويسي با مکانيسم هاي کنترلي قابل ملاحظه اي انجام ميشود. عناصر تنظيمي به فرم سيس3 در بالادست ژنهاي DAS، CAT4 و FMD5 با نقش مهاري براي گلوکز شناسايي شده اند.
1-3 نقشه ژنتيکي
آناليز تتراد در هانسونلا پلي مورفا امکان پذير است اما اندازه کوچک اسپورها روند اين آناليز را کند مي نمايد. در کشت سلول هاي ديپلوئيدي تفکيک مندلي نرمال در مورد بيشتر مارکرهاي ژنتيکي مشاهده شده است.
الکتروفورز DNA کروموزومي هانسونلا پلي مورفا به روش pulse field، 3 تا 7 باند را نشان داده است که به نوع سويه وابسته است (Mari, 1993)اما بطور کلي مشخص شده است که هانسونلا پلي مورفا حداقل 7 کروموزوم دارد که بعضي از آنها مضاعف (دو تايي) هستند (Naumov, 1992).
1-4 توليدمثل و اسپورزايي
فاکتورهايي در توليدمثل و اسپورزايي هانسونلا پلي مورفا درگيرند که هنوز بطور کامل شناسايي نشده اند. از القاء کننده هاي قوي توليدمثل جنسي ميتوان به مالتوز، گليسرول و سوربيتول اشاره کرد (Lahtchev, unpublished data).
سلول هاي هاپلوئيد بر اساس نوع فنوتيپشان به چهار گروه تقسيم ميشوند:
سويه هاي گروه 1 و 2 ميتوانند هيبريداسيون متقاطع6 داشته باشند. اين سويه ها سريع الرشد و تهاجمي بوده و پس از گذشت يک روز در محيط انتخابي، ديپلوئيدي مي شوند. سويه هاي گروه 3 توانايي جفتگيري با اعضاي گروه 1 و 2 را دارند و سويه هاي مثبت (+) نامگذاري مي شوند. سويه هاي گروه 4 تنها ميتوانند با گروه مثبت جفتگيري کنند و گروه منفي (-) را تشکيل دهند.
1-4-1 اسپورزايي
در هانسونلا پلي مورفا سلولهاي هاپلوئيدي توانايي اسپورزايي دارند. اسپورزايي هاپلوئيدها بعد از گذشت 8 روز در محيط حاوي 3% مالتوز در دماهاي پائين قابل تشخيص است. اسپورزايي با ظاهر شدن کلني هاي ديپلوئيدي به رنگ صورتي روشن همراه مي باشد.
در اواخر دهه 1960 کشف شد که مخمرها توانايي رشد بر روي محيط حاوي متانول به عنوان منبع کربن و انرژي را دارند (Ogata, 1969). اخيراً در تحقيقات پايه، متيلوتروف ها به عنوان منبع پروتئين هاي تک سلولي7 (SCP) ((Cooney and Levine, 1976) و آنزيم هاي غيرمعمول و متابوليت ها توجه بسياري را به خود جلب کرده اند. با استفاده از روشهاي جديد کلونينگ، ژن هاي کد کننده آنزيم هاي کليدي در متابوليسم متانول شناسايي شده اند (Wegner, 1990).
پروموترهاي MOX و FMD بعد از القاء، بسيار قوي عمل مي نمايند. اين مطلب با مشاهده ميزان بالاي بيان محصولات تحت تأثير اين پروموترها قابل انتظار است.
اين يافته ها استفاده از هانسونلا پلي مورفا، به عنوان يک ميزبان مناسب براي بيان به ميزان زياد ژنهاي هترولوگ با استفاده از اين پروموترها، به عنوان اجزاء کنترل کننده بيان، را قابل قبول نمايد (Roggenkamp, 1984; Hollenberg and Janowicz, 1988).
سيستم بياني شامل هانسونلا پلي مورفا سويه RB11 و پلاسميدهاي حاوي توالي هاي URA3و HARS18 است که به دنبال هم قرار گرفته اند. استفاده از پروموترهاي FMD يا MOX و ترميناتور MOX همراه با جايگاههاي برش آنزيمي کوتاه مربوط به کلونينگ9 (MSC) بين اين دو واحد، کلونينگ و بيان ORF10هاي هترولوگ را ممکن ساخته است.
آناليز سويه هاي بياني، پايداري ميتوزي قابل توجه پلاسميد هاي الحاق شده به درون ژنوم را نشان مي دهد که در بعضي موارد بيانگر سرعت بيان بالاي ORF هترولوگ مي باشد.
از طرف ديگر، سويه RB11، اغلب دستکاري هاي ژنتيکي به صورت نوترکيبي را به راحتي نمي پذيرد که شايد ناشي از پايداري ميتوزي فوق باشد. به نظر مي رسد سويه DL-1 نسبت به سويه RB11 توانايي پذيرش بيشتري را دارد (Gellissen, 1992).
1-6 پروموترهاي مورد استفاده در سيستم هاي بياني هانسونلا پلي مورفا RB11
يکي از پروموترهاي مورد استفاده براي توليد پروتئينهاي هترولوگ در هانسونلا پلي مورفا سويه RB11، پروموتر ژن MOX مي باشد که طول آن بيش از 5/1 کيلوباز بوده و در حضور منبع کربن تنظيم مي شود. به اين صورت که در حضور گلوکز، پروموتر MOX مهار مي شود ولي در حضور متانول، القاء مي گردد.
پروموتر ساير ژن هاي کدکننده آنزيم هاي کليدي در کاتابوليسم متانول از جمله FMD، DAS و CAT نيز مشابه با پروموتر ژن MOX کنترل مي شوند اما سطح تنظيمي بعضي از آنها همچون CAT مشخص نيست (Veenhuis, 1983).
اگرچه پروموترهاي FMD و MOX به طور واضحي مقايسه نشده اند اما بعضي مقايسه ها نشان داده است که مزاياي پروموتر FMD از پروموتر MOX بيشتر است. بعنوان مثال، هانسونلا پلي مورفا سويه RB11 بيان کننده ژن فيتاز تحت کنترل پروموتر FMD، بازده زيادي در تخمير در شرايط قحطي گلوکز دارد.
1-6-1 HARS1
پلاسميدهاي بياني مورد استفاده در هانسونلا پلي مورفا سويه RB11 داراي عنصر HARS1 به طول تقريبي 5/0 کيلوباز مي باشند. اين قطعه ژني در سالهاي اخير در طراحي وکتورهاي مناسب براي انتقال به هانسونلا پلي مورفا مورد توجه قرار گرفته است Roggenkamp, 1986)). پلاسميدهاي حامل توالي HARS1 در 30-20 نسل ابتدايي رشد سلولها به صورت اپي زومال باقي مي مانند اما پس از آن در ژنوم سلول مزبان به صورت تکرارهاي متوالي به تعداد زياد الحاق مي شوند. اين در حالي است که ناحيه اي که اين پلاسميدها دقيقاً در ژنوم ادغام مي شوند هنوز مشخص نيست Gellissen, 1990)). چهار عنصر ديگر از خانواده قطعه ژني HARS در سويه هاي DL-1 به دست آمده است اما تعداد کپي آنها از تعداد عناصر HARS1 در سويه RB11 کمتر است.
جزئيات مکانيسم ادغام شدن پلاسميدهاي حاوي توالي HARS1 در ژنوم اين مخمر هنوز مشخص نيست. تنها ويژگي شناخته شده، توانايي ادغام شدن به صورت تواليي تکراري و غيرتصادفي است که قسمت خاصي از ژنوم را انتخاب مي کند (Sohn, 1996).
شکل 1-3 تصوير پلاسميد بياني مخمر H. polymorpha
1-7 بيان همزمان11:
با چنين سيستم هايي، مجموعه هاي پروتئيني هترومري توليد مي شود. يک مثال قابل توجه از اين نوع بيان، بيان همزمان آنتي ژن هاي S و Lويروس هپاتيت B است.
از ديگر موارد بيان همزمان ميتوان به بيان ژن هاي کد کننده گليکولات اکسيداز (GO) اسفناج و کاتالاز (CTT1) T ساکاروميسس سرويزيه در هانسونلا پلي مورفا اشاره نمود.
بيان، پردازش، تغيير و تبديل و يا ترشح مؤثر پروتئينهاي نوترکيب خاص در هانسونلا پلي مورفا ممکن است دچار تغيير شود. اين محدوديت مي تواند با بيان همزمان ژن مورد نظر با يک ژن دوم (يا بيش از يک ژن ديگر) برطرف شود به همراه مي آورد. به عنوان مثال فرآيند پردازش نادرست اينترفرون آلفا 2a، مي تواند با بيان همزمان ژن KEX2 ساکاروميسس سرويزيه بهبود يابد.

1-8 ترشح پروتئين هاي هترولوگ اليگومري و فعال
هانسونلا پلي مورفا مقدار کمي پروتئين دروني (خودي) ترشح مي کند و در نتيجه اين ويژگي، پروتئين هاي هترولوگ ترشح شده به محيط کشت، عموماً خالص هستند. بنابراين استفاده از اين ميزبان بياني، روش مناسبي جهت توليد پروتئين هاي نوترکيب خارجي به فرم محلول مي باشد. ترشح پروتئين ها توسط تواليهاي نشانه (سيگنال) قابل جداسازي انجام مي شود. اگرچه گاهاً مستقل از سيگنال ترشحي، در مواردي ترشح خودبخودي پروتئين هترولوگ نيز مشاهده شده است (Gellissen, 2000).
براي درک توانايي هانسونلا پلي مورفا در توليد و ترشح پروتئين هاي هترولوگ، سويه هايي از اين مخمر به منظور ترشح الکل اکسيداز (AOX) مهندسي گرديدند. الکل اکسيداز، يک پروتئين هومواکتامر کوفاکتوري است که هر زيرواحد آن داراي يک مولکول FAD12 مي باشد (van der Klei et al, 1991). زمانيکه هانسونلا پلي مورفا بر روي محيط حاوي متانول رشد مي کند فعاليت پروتئين AOX در ماتريکس پراکسي زومي، جائيکه اکثر پروتئين هاي اصلي وجود دارند، محدود مي شود.
از طرف ديگر، براي فهم چگونگي ترشح الکل اکسيداز، سويه هايي از هانسونلا پلي مورفا مهندسي گرديد که ژن اندوژن AOX با ژن AOX به دنبال سيگنال ترشحي در انتهاي N، جايگزين شد. به دنبال کشت اين سويه در محيط کشت حاوي متانول، حضور AOX فعال شناسايي گرديد که اين بيان نشان مي دهد هانسونلا پلي مورفا قادر به توليد و ترشح کمپلکسهاي پروتئيني داراي کوفاکتور و ساختارهاي اليگومري مي باشد (van der Heide and Veenhuis, Unpublished results).

1-9 توليد واکسن نوترکيب
در بسياري از کشورها واکسن هاي عليه هپاتيت در اوايل دهه 1980 در دسترس عموم قرار گرفت. اين واکسن ها با جداسازي آنتي ژن HBs13 از سرم افراد ناقل توليد شده بود که اگرچه مؤثر بودند اما به دليل مشتق شدن از سرم، گران بوده و مدت زمان کوتاهي به سيستم ايمني عرضه مي شوند. به همين دليل، توليد آنتي ژن HBS هترولوگ در سيستم هاي بياني مختلف از جمله مخمر، باکتري، سلولهاي گياهي يا جانوري و نيز حيوانات تراريخته توسعه پيدا نمود. (Billman-Jacobe, 1996, Makrides, 1996).

1-10 مخمرها به عنوان ميکروارگانيسم هاي توليدي
سيستم هاي مخمري داراي مزايايي از جمله توانايي دستکاري ژنتيکي آسان، فرآيند هاي پس از ترجمه يوکاريوتي با ميزان بالاي توليد محصول و فرآيندهاي تخميري ارزان قيمت هستند. بنابراين تعجب آور نيست که ساکاروميسس سرويزيه به عنوان يکي از ميزبانهاي مطلوب در توليد پروتئين هاي هترولوگ شناخته شده است (Hinnen et al, 1995; Barr et al, 2000).
تاکنون دو روش در سيستم بياني هانسونلا پلي مورفا به منظور توليد زيرواحدهاي adw2 و adr از آنتي ژن HBs ابداع شده است که يکي از آنها توسط سازمان بهداشت جهاني (WHO) تأييد شده است (Gregg et al, 1985; Gregg and Madden, 1987).
1-10 ساخت سويه هانسونلا پلي مورفا بيان کننده آنتي ژن HBs
به طور کلي توليد سويه هاي هانسونلا پلي مورفا نوترکيب نيازمند دنبال کردن پروتکل استاندارد زير است:
1. توليد کاست بياني و وکتور پلاسميدي
2. انتقال وکتور طراحي شده به سلول هانسونلا پلي مورفا
3. جداسازي سويه هاي نوترکيب
1-10-1 توليد کاست بياني و وکتور پلاسميدي
توليد سويه H415 بيان کننده آنتي ژن HBs بوسيله گروهي از محققين يک مثال از اين فرآيند است. توالي کدکننده آنتي ژن به طول 683 نوکلئوتيد از پلاسميد pRIT10616 جدا گرديد (Harford et al, 1987) و قطعه پروموتريMOX به عنوان سيگنال براي رونويسي از ژن MOX هانسونلا پلي مورفا مشتق شد (Ledeboer et al, 1985; Eckart 1988). اين سه عنصر ترکيب شده و قطعه MOX promoter-HBsAg gene-MOX terminator را تشکيل مي دهند که اساس کاست بياني مي باشند (Stinchcomb et al, 1980). سپس اين کاست داراي عملکرد بياني درون وکتور پلاسميدي حاوي عناصر زير قرار داده شد. ژن مقاومت به کلرامفنيکل به منظور تکثير در باکتري E. coli، توالي همانند سازي هانسونلا پلي مورفا (HARS1) و ژن URA3 از ساکاروميسس سرويزيه به عنوان مارکر انتخابي14 در بررسي انتقال پلاسميد به هانسونلا پلي مورفا مي باشند.
پلاسميدهاي داراي توالي HARS1 توانايي بالايي براي ادغام در ژنوم ميزبان دارند. امروزه سويه هايي شناسايي شده که داراي بيش از 60 کپي از کاست بياني خارجي اند که اين مطلب به دليل وجود اين توالي مي باشد.

1-11 انتقال (ترانسفرم) وکتورهاي بياني به هانسونلا پلي مورفا
1-11-1 روش پلي اتيلن گليکول
پلاسميدpRBS-269 با استفاده از روش پلي اتيلن گلايکول به سويه RB10 انتقال يافت و براي مشخص شدن ادغام پلاسميد به درون ژنوم، غربالگري صورت گرفت (Gregg et al, 1985).
تاکنون چندين سويه ترانسفرم شده با کاست هاي بياني الحاقي بطور پايدار توليد شده است و سويه H415 يکي از اين سويه هاست که براي بيان آنتي ژن HBs تحت شرايط خاص مورد آزمايش قرار گرفته است (Janowicz et al, 1991).

1-12 جداسازي سويه هاي نوترکيب
تشخيص بيان پروتئين با رشد سويه هاي ترنسفورم شده بر روي محيط هاي تقريباً مغذي حاوي گلوکز، گليسرول و يا متانول بررسي مي شود. در اين راستا، مقدار آنتي ژنHBs توليد شده در اين سيستم بياني در مقايسه با مقدار استاندارد آنتي ژن خالص با روش ايمونوبلاتينگ کمي اندازه گيري شد. ميزان توليد د ر سويه H415 در محيط کشت حاوي متانول mg100 بود. زمانيکه سلول ها در محيط حاوي گليسرول قرار گرفتند سنتز آنتي ژن HBs 70% کاهش پيدا کرد و زمانيکه سلول ها به محيط حاوي گلوکز منتقل شدند آنتي ژني توليد نگرديد که اين مطلب نشان دهنده توليد اين آنتي ژن به طور طبيعي تحت کنترل ژن MOX ميباشد (Rutgers et al, 1988).
1-13 تنظيم متابوليسم متانول
تنظيم آنزيم هاي احياکننده15 به روش مهاري و نه القاء صورت مي پذيرد. در طي فرايند رشد، در شرايط کمبود گلوکز اين آنزيم ها افزايش پيدا مي کنند (Egli, 1980). تجزيه و تحليل منطقه پروموتر ژن کد کننده AOD نشان داده است که در H. polymorpha بيان ژن MOX نيز توسط يک مکانيسم مهاري تنظيم مي شود (Roggenkamp, 1984; Sakai and Tani, 1992).
1-14 فاکتور محرک رشد کلني گرانولوسيتي16 (G-CSF)
در دهه 60 ميلادي، دو گروه به طور همزمان روش هايي را براي توسعه و بهبود رشد کلني هاي گرانولوسيتي و مونوسيتي مغز استخوان موش و يا سلول هاي طحال بر روي آگار نيمه جامد مورد بررسي قرار دادند. رشد کلني اين سلولها به حضور فاکتورهايي بستگي دارد که اصطلاحاً آنها را فاکتورهاي محرک رشد کلني(CSF) مي نامند. تلاش براي شناخت بيولوژيکي و بيوشيميايي اين محرکها آزمايشگاههاي زيادي را تا اواسط دهه 80 ميلادي درگير کرده بود (Metcalf, 2010). اين تحقيقات نشان دادند که CSF ها عملکردي اختصاصي و مجزا ندارند بلکه چهار CSF که از نظر بيوشيميايي کاملاً متفاوت هستند با هم همکاري مي کنند. اين چهار CSF با توجه به نوع فعاليت شان بر روي کلني هاي متفاوت، نامگذاري شدند. به طور مثال GM-CSF که محرک رشد کلني ماکروفاژها و گرانولوسيت ها مي باشد.M-CSF محرک توليد کلني ماکروفاژها و G-CSF محرک رشد کلني گرانولوسيتي مي باشد.
1-15 ژن gcsf
اين ژن بر روي کروموزوم 17 قرار گرفته و داراي 4 اينترون است. دو نوع پلي پپتيد متفاوت در نتيجه پردازش هاي مختلف از اين ژن ايجاد مي شود. تفاوت اين دو پلي پپتيد در وجود و يا عدم وجود 3 اسيد آمينه مي باشد. مطالعات انجام گرفته بر روي بيان اين دو نشان مي دهد که هر دوي آنها داراي فعاليت هاي مربوط به GCSF مي باشند.
1-16 پروتئين GCSF
فاکتور محرک رشد کلني گرانولوسيتي (GCSF)که فاکتور محرک کلني317 هم ناميده مي شود، يک سيتوکين وهورمون محرک رشد و داراي 175 اسيد آمينه مي باشد. گليکوپروتئين هاي طبيعي انساني در دو فرم وجود دارند. 174 آمينو اسيدي و 180 آمينو اسيدي که پروتئيني طويل با وزن مولکولي 19600 دالتون مي باشد. فرم 174 آمينو اسيدي بيشترين فعاليت را دارد که در محصولات دارويي به کمک تکنولوژي DNA نوترکيب ساخته مي شود. اين فاکتور در بافت هاي مختلف اثربخشي خود را از طريق تحريک مغز استخوان براي ساخت گرانولوسيت و سلولهاي بنيادي انجام مي دهد.GCSF همچنين توسط اندوتليوم، ماکروفاژها و تعدادي از سلولهاي ايمني توليد مي شود.

شکل 1-4 ساختار کريستالي از 3 مولکول G-CSF انساني
1-17 عملکرد پروتئين GCSF
G-CSF مغز استخوان را براي انتشار گرانولوسيت و سلولهاي بنيادي در خون تحريک مي کند. اين پروتئين همچنين باعث تحريک بقاء، تکثير، تمايز و عملکرد پيش سازه هاي نوتروفيلي و نوتروفيل هاي بالغ مي شود که تنظيم اين واکنش ها از طريق Janus kinase (JAK)، مبدل سيگنال و فعال کننده رونويسي STAT، پروتئين کيناز ميتوژني فعال (MAPK) و فسفاتيديل اينوزيتول-3-کيناز انجام ميشود.
شکل 1-5 مکانيسم عملکرد GCSF

گيرنده هاي GCSF بر روي سلول هاي پيش ساز مغز استخوان قرار دارند و در پاسخ به GCSF تحريک مي شوند و اين باعث رشد و تمايز اين سلول ها به گرانولوسيت بالغ مي شود. اين پروتئين همچنين يک القاء کننده قوي براي انتقال سلول هاي بنيادي خون ساز هماتوپويتيک از مغز استخوان به درون خون مي باشد (Wonganu, 2008).
GCSF همچنين محرک توليد گلبولهاي سفيد خون نيز مي باشد و در انکولوژي و هماتولوژي، در بعضي سرطان هاي خاص براي افزايش سرعت بهبودي افراد نوتروپني بعد از شيمي درماني از شکل نوترکيب آن استفاده مي شود. شيمي درماني سبب توليد سطح غير قابل قبول (کم) سلولهاي سفيد خون مي شود که اين مورد بيماران را در مقابل حملات ميکروبي و عفونت ها حساس مي نمايد.
به نظر ميرسدGCSF براي يک بارداري امن در طي مرحله لانه گزيني مؤثر باشد که اين امر در بارداري هاي دوم و سوم بيشتر مي شود (Strife, 2013).
در کنار تاثير بر روي سيستم خون سازي، GCSF همچنين مي تواند بر روي سلول هاي عصبي به عنوان مثال فاکتور نوتروفيک تأثير بگذارد. در واقع گيرنده هاي اين گليکوپروتئين بر روي نورون هاي مغز و نخاع ظاهر مي شوند (Cooper, 2011).
همچنين از GCSF براي درمان تخريب بافت قلب از طريق تزريق در خون محيطي به همراهSDF stromal) (cell-derived factor استفاده مي شود (Anderlini, 2005) .
امروزهGCSF نوترکيب انساني در سيستم بياني باکتري E. coli توليد مي شود که با نام فيلگراستيم شناخته شده است. فيلگراستيم از لحاظ ساختاري تفاوت کمي با گليکوپروتئين طبيعي GCSF دارد. فيلگراستيم (Neupogen) و فيلگراستيم پگيله شده (Neulasta) (PEG-filgrastim) دو نوع تجاري متداول فرم نوترکيب GCSF انساني rhG-CSF هستند. فرم پگيله، نيمه عمر طولاني تري دارد و اين موضوع سبب کاهش ضرورت تزريق روزانه اين دارو مي شود.
شکل ديگر GCSF نوترکيب انساني در سلولهاي تخمدان هامستر چيني (CHO cells) ساخته مي شود که با نام لنوگراستيم شناخته مي شود. از آنجا که اين سيستم بياني در سلول پستانداران مي باشد، لنوگراستيم توليدي تفاوت بسيار کمي (غير قابل تشخيص) در 174 آمينو اسيد با GCSF طبيعي انسان دارد.
براي اولين بار در سال 1999 در آکادمي بيوتکنيک چين، ژنوم انسان به عنوان رشته الگو براي کلونينگ و بيان GCSF در غدد پستاني موش استفاده شد و قطعه اي به طول 5/1 کيلوباز با PCR بدست آمد(Lu, 1999).
در سال 2009 محققين به بيان پروتئين نوترکيب GCSF در مخمرPichia Pastoris پرداختند که نتيجه اين تلاش بيان اين پروتئين تحت پروموتور AOX1 بوده که در نتيجه القاء با متانول ميزان پروتئين شده به 2 ميلي گرم در ليتر رسيد (Apte-Deshpande, 2009).
در سال 1387 محققين ايراني به جهش زايي هدفمند در فاکتور محرک رشد کلني گرانولوسيت انساني و کلونينگ و بيان آن در باکتري E. coli پرداختند و نتايج آنها نشان داد که پروتئين نوترکيب مورد نظر با موفقيت در سيستم پروکاريوتي کلون و بيان شده است (حامد ناقوسي، 1387).
به دليل اهميت باليني بالا و نيز نياز گسترده به GCSF در مراقبت هاي بهداشتي، تلاش هاي زيادي به منظور توليد مولکولهاي مشابه با فرم طبيعي انساني آن که داراي عملکرد باشند در حال انجام است.
در سالهاي گذشته محققين ايراني سعي در بيان آن در کاهوي تراريخته داشتنه اند چراکه در اين سالها گياهان تراريخته براي توليد انواع داروي نوترکيب و واکسن ها مورد استفاده قرار گرفته اند (مهدي شريفي تبار،1392).

فصل دوم مواد و روش ها
2-1 ميکروارگانيسم هاي مورد استفاده
از باکتري E. coli سويه ‘ TOP10F به منظور کلونينگ و تکثير پلاسميدها و از مخمر Hansenula polymorpha سويه RB11 به عنوان ميزبان بياني مخمري استفاده شد.

2-2 محيط هاي کشت مورد نياز
جهت رشد باکتري‌ E. coli از محيط کشت LB جامد يا مايع و جهت رشد مخمر از محيطهاي کشت YPD جامد يا مايع، BMMY و BMGY استفاده شد (پيوست 1).
پس از آماده نمودن محيط¬هاي كشت ميکروبي مورد نياز، اين محيط ها در دماي 121 درجه سانتيگراد به مدت 15 دقيقه در فشار يك اتمسفر اتوكلاو گرديدند. محلول‌هاي قندي يا محلولهاي حساس به اتوكلاو با استفاده از فيلترهاي 22/0 ميکرون استريل شدند.

2-3 پلاسميدهاي مورد استفاده
وکتور کلونينگ pGH براي کلون نمودن ژن سنتز شده gcsf توسط شرکت مربوطه مورد استفاده قرار گرفت (شکل 3-1). وکتور بياني مورد نياز براي سلولهاي مخمري به صورت سنتتيک و با درج عناصر ضروري جهت بيان پروتئين هاي هترولوگ در اين سلولها با استفاده از وکتور کلونينگ pGH به عنوان وکتور اوليه ساخته شده است.

شکل 3-1. وکتور کلونينگ pGH

2-4 آنزيم ها و کيت‌ها
آنزيم Taq DNA polymerase، آنزيم هاي محدودالأثر، RNaseA و آنزيم T4 DNA ligase از شرکت Fermentas تهيه شدند.
کيت استخراج محصول PCR يا DNA از ژل آگارز از شركت Roche تهيه گرديد.

2-5 آنتي بيوتيکها
آنتي بيوتيک ها (آمپي سيلين، تتراسايکلين و زئوسين) با غلظت مناسب (پيوست 2) تهيه و در 20- درجه سانتيگراد نگهداري شدند.

2-6 روش هاي عمومي
2-6-1 الکتروفورز افقي محصول PCR و يا نمونه DNA بر روي ژل آگارز
به منظور بررسي نتايج PCR و يا کيفيت هرنوع مولکول DNA، از ژل آگارز استفاده مي شود. به همين جهت ابتدا ژل آگارز با غلظت متناسب با سايز مولکول مورد بررسي تهيه مي شود. با توجه به ظرفيت کاست ژل، ابتدا پودر آگارز وزن شده و سپس در حجم مشخصي از بافر TAE (پيوست 3) با رقت X1 حل مي گردد. اين مخلوط به مدت 10 دقيقه در دماي اتاق باقي مانده و سپس مخلوط به مدت 1 دقيقه جوشانده مي شود تا به خوبي حل شده و محلول يکنواختي حاصل شود. پس از کاهش دماي محلول تا حدود °C40، به ميزان لازم از محلول رنگي DNA Safety Stain به آن اضافه کرده و به آرامي به درون کاست ژل ريخته شده و شانه روي آن قرار داده مي شود. پس از چند دقيقه و پس از بستن کامل ژل، شانه به آرامي و به صورت عمودي از داخل آن خارج ‌شده و ژل به همراه کاست در داخل تانك الكتروفورز افقي حاوي بافر TAE (X1) قرار داده مي شود. در ادامه نمونه هاي DNA همراه با حجم مشخصي از بافر بارگذاري ، با ترتيب مشخص به آرامي به درون چاهك ها ريخته مي شود. سپس الکترودهاي تانک به منبع تغذيه متصل مي شود. پس از گذشت مدت زمان مشخص با توجه به اندازه قطعه، جريان برق قطع گشته و ژل از درون کاست خارج مي گردد. ژل را در معرض نور فرابنفش قرار داده و باندها را مشاهده مي نماييم.
نکته: در صورتي که قرار است DNA از ژل تخليص شود، به هيچ‌وجه نمي‌بايست به مدت طولاني در معرض اشعه فرابنفش قرار گيرد زيرا اين اشعه طول موج پاييني داشته و قادر است در توالي DNA جهش ايجاد کند.
2-6-2 تخليص محصول هضم آنزيمي با استفاده از کيت تخليص از ژل آگارز
جهت انجام کلونينگ، تخليص محصول هضمهاي آنزيمي فوق با استفاده از کيت تخليص از ژل (Roche) و بر اساس پروتوکل موجود در کيت به شرح زير انجام ‌شد:
1.به ازاي هر mg100 ژل آگارز بريده شده ، µl300 بافر 1 (Binding buffer) به هر تيوب اضافه گرديد.
2.تيوب ها به مدت 30-15 ثانيه ورتکس شده و سپس به مدت 10 دقيقه در دماي C°56 گرماگذاري شدند.
3.در اين مرحله به ازاي هر mg100 ژل اوليه، µl150 ايزوپروپانول به تيوب ها اضافه شده وسپس ورتکس گرديدند.
4.محتويات هر تيوب به يکي از ستون هاي کيت افزوده شده و اين مجموعه را با بالاترين سرعت (rpm13000) به مدت 30-60 ثانيه سانتريفوژ نموديم.
5.مايع زيرين دور ريخته شده و سپس µl500 بافر شستشو به هر ستون اضافه گرديد.
6.پس از سانتريفوژ در بالاترين سرعت به مدت 1 دقيقه، مايع زيرين دور ريخته شده و در اين مرحله µl250 بافر شستشو مجدداً اضافه گرديد.
7.پس از سانتريفوژ به مدت 1 دقيقه (در بالاترين سرعت)، هريک از ستون ها را به تيوب هاي 5/1 ميلي ليتري انتقال داده و µl35 آب ديونيزه به فيلتر ستون ها اضافه کرده و پس از انکوباسيون 5 دقيقه اي در دماي اتاق، هريک از تيوبها را مشابه با مراحل قبلي سانتريفيوژ نموديم.

2-6-3 واکنش ليگاسيون قطعات تخليص شده
واكنش ليگاسيون پس از تعيين غلظت وكتور و قطعه الحاقي تخليص شده از ژل آگارز، بر طبق واکنش مندرج در جداول مربوطه انجام گرفت. در نمونه کنترل منفي، وکتور خطي شده به تنهايي در يک واکنش ليگاسيون وارد گرديد. به عبارت ديگر، در اين واکنش به جاي قطعه DNA، آب ديونيزه به مخلوط واکنش اضافه گرديد. تمامي تيوب ها به مدت 16 ساعت (ON) در دماي °C4 گرماگذاري شدند. اين دما كمك مي‌كند تا تشكيل پيوندهاي هيدروژني بين انتهاهاي چسبنده آسان‌تر و با پايداري بيشتري انجام شود و آنزيم ليگاز نيز زمان كافي براي تشكيل پيوند فسفودي‌استري را خواهد داشت.

2-6-4 تهيه سلول‌ هاي مستعد ‘E. coli TOP10F به روش تيمار با کلريد کلسيم
باکتري مستعد، سلولي است که توانايي لازم براي وارد نمودن پلاسميد به درون خود را پيدا کرده است.
1.يک کلني از باکتري مورد نظر به مدت 3-2 ساعت در حضور تتراسايکلين در محيط LB مايع و در دماي °C37 بر روي شيکر با سرعت rpm 150 كشت داده شد تا جذب نوري محيط کشت در طول موج nm600 (OD600nm) به 6/0-4/0 رسيد.
2.محيط کشت در شرايط استريل (در كنار شعله) به ميکروتيوپ استريل منتقل شده و با سرعت rpm9000 به مدت 3 دقيقه سانتريفوژ شد.
3.محيط کشت دور ريخته شده و رسوب سلولي در µl720 كلريد سديم mM100 سرد استريل، حل شده و به مدت 20 دقيقه در يخ گذاشته شد.
4.پس از گذشت اين مدت، سوسپانسيون باکتريايي با دور rpm9000 و به مدت 3 دقيقه سانتريفوژ شده و مراحل 3 و 4 تکرار شدند.
5.رسوب باکتريايي حاصل در µl300 محلول کلريد کلسيم حل گرديد.

2-6-5 انتقال پلاسميد به سلول هاي مستعد (ترانسفورماسيون)
1.µl100 از سوسپانسيون سلول هاي مستعد به تيوپ استريل انتقال داده شد.
2.حجم مشخصي از پلاسميد و يا محصول ليگاسيون به سوسپانسيون باکتريايي اضافه شده و تيوب ها به مدت 30



قیمت: تومان


پاسخ دهید