دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشکده کشاورزي
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد در رشته مهندسي کشاورزي علوم باغباني
گرايش فيزيولوژي و اصلاح گياهان دارويي ومعطر
عنوان
بررسي تغييرات اسانس حاصل از گياه بهليمو در شرايط كشت بافت و مزرعه
استاد راهنما
دکتر کمال قاسمي بزدي
استاد مشاور
دکتر بهاره كاشفي
نگارنده
ميثم گل‌پرور
زمستان 1392
سپاسگزاري
سپاس خداي را که سخنوران، در ستودن او بمانند و شمارندگان، شمردن نعمت‌هاي او ندانند و کوشندگان، حق او را گزاردن نتوانند. و سلام و دورد بر محمّد و خاندان پاك او، طاهران معصوم، هم آنان که وجودمان وامدار وجودشان است…
بدون شک جايگاه و منزلت معلم، اجّل از آن است که در مقام قدرداني از زحمات بي‌شائبه‌ي او، با زبان قاصر و دست ناتوان، چيزي بنگاريم. اما از آنجايي که تجليل از معلم، سپاس از انساني است که هدف و غايت آفرينش را تامين مي‌کند و سلامت امانت‌هايي را که به‌دستش سپرده‌اند، تضمين؛ برحسب وظيفه: ازپدر و مادر عزيزم اين دو معلم بزرگوارم، که همواره بر کوتاهي و درشتي من، قلم عفو کشيده و کريمانه از کنار غفلت‌هايم گذشته‌اند و در تمام عرصه‌هاي زندگي يار و ياوري بي چشم داشت براي من بوده‌اند؛ از استاد با کمالات و شايسته؛ جناب آقاي دکتر کمال قاسمي بزدي که در کمال سعه صدر، با حسن خلق و فروتني، از هيچ کمکي در اين عرصه بر من دريغ ننمودند و زحمت راهنمايي اين رساله را بر عهده گرفتند؛ از استاد صبورم ، سرکار خانم دکتر بهاره کاشفي که زحمت مشاوره اين رساله را در حالي متقبل شدند که بدون مساعدت ايشان، اين پروژه به نتيجه مطلوب نمي‌رسيد؛ و از استاد فرزانه و دلسوز؛ جناب آقاي دکتر شهرام رضوان بيدختي که زحمت داوري اين رساله را متقبل شدند؛ از همسر خوب و مهربانم که با دلگرمي در پيشرفت اين مرحله از زندگي‌ام همراهم بودند و همچنين تمامي دوستان گرامي که در امر نگارش اين رساله ياري‌ام نمودند کمال تشکر و قدرداني را دارم.
باشد که اين حقير، بخشي از زحمات آنان را سپاس گويد .
فهرست مطالبعنوانصفحهچکيده ………………………………………………………………………1فصل اول: مقدمه و کليات1-1 گياهان دارويي ……………………………………………………………21-1-1 اهميت كشت گياهان دارويي ………………………………………………21-1-2 تاريخچه گياهان دارويي ………………………………………………….31-2 به‌ليمو ……………………………………………………………………51-2-1 تاريخچه و معرفي بهليمو…………………………………………………..51-2-2 بهليمو (Lemon verbena) از نظر ردهبندي گياهي ………………………………..61-2-3 گياهشناسي بهليمو ……………………………………………………….61-2-4 نامهاي ديگر بهليمو ………………………………………………………61-2-5 گونه‌هاي ديگر به‌ليمو …………………………………………………….61-2-6 منشأ و پراکنش بهليمو در ايران …………………………………………….71-2-7 اهميت اقتصادي بهليمو ……………………………………………………81-2-8 روش پرورش گياه بهليمو …………………………………………………81-2-9 زمان جمعآوري بهليمو ……………………………………………………91-2-10 خواص دارويي و كاربردهاي بهليمو ………………………………………..101-2-11 مواد تشكيلدهنده اسانس بهليمو …………………………………………..101-2-12 فرمولهاي شيميايي و شكل نمايي از برخي مواد تشكيل دهندهي اسانس به‌ليمو ……..111-3 كشت بافت ………………………………………………………………121-3-1 کشت کالوس …………………………………………………………..141-3-2 توليد متابوليتهاي ثانويه …………………………………………………141-3-3 باززايي گياه ……………………………………………………………151-4 کشت بافت گياهان دارويي …………………………………………………..151-5 اهميت تكثير بهليمو از طريق كشتبافت ………………………………………..171-6 اهداف تحقيق …………………………………………………………….17
فصل دوم: مروري بر تحقيقات انجام شده 2-1 گياهان دارويي ……………………………………………………………182-2 کشت بافت بهليمو …………………………………………………………202-3 کشت بافت در ساير گياهان ………………………………………………….212-4 ميزان ماده موثره بهليمو ………………………………………………………222-5 خواص ضدميکروبي بهليمو …………………………………………………..232-6 تغذيه و کودهاي زيستي …………………………………………………….24فصل سوم: مواد و روش‌ها3-1 زمان و مكان انجام آزمايش …………………………………………………..303-2 مواد گياهي ………………………………………………………………303-3 عمليات كشت بافت ………………………………………………………..303-3-1 ترکيبات هورموني بکار رفته در محيط کشت ………………………………….303-3-2 طرز تهيه محلول‌هاي ذخيره‌اي تركيبات محيط كشت ……………………………313-3-3 آمادهسازي تنظيم کنندههاي رشد گياهي ………………………………………323-3-3-1 تهيه محلول پايه BAP ………………………………………………….323-3-3-2 تهيه محلول پايه كينتين ………………………………………………….323-3-3-3 تهيه محلول پايه2,4-D …………………………………………………323-3-3-4 تهيه محلول پايه NAA…………………………………………………..323-3-4 آماده‌سازي محيط کشت‌هاي مختلف ………………………………………….323-3-4-1 آماده سازي محيط کشت جامد …………………………………………….343-3-4-2 آماده سازي محيط کشت مايع …………………………………………….343-3-5 تهيه و سترون سازي ريزنمونههاي بهليمو …………………………………….343-3-6 كشت ريزنمونههاي بهليمو ………………………………………………..353-3-7 روش يادداشتبرداري و صفات مورد مطالعه ………………………………….353-3-8 تجزيه و تحليل آماري ……………………………………………………363-4 كشت آزمايش مزرعه‌اي به‌ليمو ……………………………………………….363-4-1 آمادهسازي مزرعه ………………………………………………………..363-4-2 آزمايش خاك ……………………………………………………………373-4-3 تهيه و انتقاال نهالهاي بهليمو ………………………………………………373-4-5 آبياري مزرعه ……………………………………………………………373-4-6 اعمال تيمارهاي كودي …………………………………………………….373-4-7 يادداشتبرداري صفات مورد مطالعه …………………………………………383-4-8 روش برداشت و خشككردن بهليمو …………………………………………383-4-9 اسانسگيري ……………………………………………………………393-4-10 تجزيه و تحليل آماري طرح مزرعه ………………………………………….40فصل چهارم: نتايج و بحث4-1 نتايج حاصل از کشت ريزنمونههاي به‌ليمو برروي محيط کشتهاي MS حاوي 4 نوع ترکيب هورموني NAA و BAP …………………………………………………………..414-2 نتايج حاصل از کشت ريزنمونههاي به‌ليمو برروي محيط کشتهاي MS حاوي 6 نوع ترکيب هورموني NAA و 2,4-D وBAP و كينتين ……………………………………………454-3 نتايج حاصل از کشت ريزنمونههاي به‌ليمو برروي محيطکشتهاي MS حاوي 5 نوع ترکيب هورموني NAA و BAP …………………………………………………………..484-4 نتايج بهترين حالت‎هاي کشت بافت براي گياه به‌ليمو در شرايط آزمايشگاهي………………….524-5 نتايج حاصل از بررسي تاثير كودي بر عملكرد و خصوصيات مورفولوژيكي بهليمو در شرايط مزرعه ……………………………………………………………………….524-4-1 آزمون خاك ……………………………………………………………52فصل پنجم: نتيجه‌گيري5-1 نتيجه‌گيري و جمع‌بندي ……………………………………………………..555-2 نتايج آزمايش‌هاي درون شيشه‌اي ……………………………………………..555-2-1 آزمايش اول ……………………………………………………………555-2-2 آزمايش دوم ……………………………………………………………585-2-3 آزمايش سوم ……………………………………………………………605-3 آزمايش مزرعه‌اي ………………………………………………………….615-4 پيشنهادات ………………………………………………………………..63فهرست منابع …………………………………………………………………64چکيده انگليسي ……………………………………………………………….69فهرست جداولعنوانصفحهجدول 3-1 نوع و غلظت ترکيبات بکاررفته در محيط کشتهاي مورد استفاده در تحقيق ……..31جدول 3-2 مواد تشکيلدهنده محلولهاي پايه جهت تهيه محيط کشت MS بههمراه ويتامينهاي B5 …………………………………………………………………………33جدول 4-1 نتايج تجزيه واريانس حاصل از بررسي تاثير زمان يادداشتبرداري و ترکيبات هورموني محيط کشت و اثرات متقابل اين عوامل بر ميزان ريشهزايي، ساقهزايي، کالوسزايي، زندهماني، تغييررنگ و تغيير شكل گياه بهليمو …………………………………………41جدول 4-2 نتايج مقايسه ميانگين حاصل از بررسي تاثير زمان يادداشتبرداري بر واكنش ريزنمونههاي بهليمو به روش آزمون LSD………………………………………….42جدول 4-3 نتايج مقايسه ميانگين حاصل از بررسي تاثير ترکيبات مختلف هورموني بر واكنش ريزنمونههاي بهليمو به روش آزمون LSD…………………………………………..42جدول 4-4 نتايج مقايسه ميانگين حاصل از بررسي اثر متقابل زمان يادداشتبرداري و ترکيبات هورموني محيطكشت در واكنش ريزنمونههاي بهليمو به روش آزمون LSD………………..44جدول 4-5 نتايج تجزيه واريانس حاصل از بررسي تاثير زمان يادداشتبرداري و ترکيبات هورموني محيط کشت و اثرات متقابل اين عوامل بر ميزان ريشهزايي، ساقهزايي، کالوسزايي، زندهماني، تغييررنگ و تغيير شكل گياه بهليمو …………………………………………45جدول 4-6 نتايج مقايسه ميانگين حاصل از بررسي تاثير زمان يادداشتبرداري بر واكنش ريزنمونههاي بهليمو به روش آزمون LSD………………………………………….46جدول 4-7 نتايج مقايسه ميانگين حاصل از بررسي تاثير ترکيبات مختلف هورموني بر واكنش ريزنمونههاي بهليمو به روش آزمون LSD ………………………………………….46جدول 4-8 نتايج مقايسه ميانگين حاصل از بررسي اثر متقابل زمان يادداشتبرداري و ترکيبات هورموني محيطكشت در واكنش ريزنمونههاي بهليمو به روش آزمون LSD……………….48جدول 4-9 نتايج تجزيه واريانس حاصل از بررسي تاثير زمان يادداشتبرداري و ترکيبات هورموني محيط کشت و اثرات متقابل اين عوامل بر ميزان ريشهزايي، ساقهزايي، کالوسزايي، زندهماني، تغييررنگ و تغيير شكل گياه بهليمو ………………………………………..49جدول 4-10 نتايج مقايسه ميانگين حاصل از بررسي تاثير زمان يادداشتبرداري بر واكنش ريزنمونههاي بهليمو به روش آزمون LSD………………………………………….. 49جدول 4-11 نتايج مقايسه ميانگين حاصل از بررسي تاثير ترکيبات مختلف هورموني بر واكنش ريزنمونههاي بهليمو به روش آزمون LSD……………………………………………50جدول 4-12 نتايج مقايسه ميانگين حاصل از بررسي اثر متقابل زمان يادداشتبرداري و ترکيبات هورموني محيطكشت در واكنش ريزنمونههاي بهليمو به روش آزمون LSD………………..51جدول 4-13 جدول مربوط به آزمون خاك قبل و بعد از اعمال تيمارهاي كودي …………….53جدول 4-14 نتايج تجزيه واريانس حاصل از بررسي تاثير تيمارهاي مختلف كود ازت و NPK بر عملكرد و تعدادي از خصوصيات مورفولوژيكي گياه بهليمو ……………………………54جدول 4-15 نتايج مقايسه ميانگين حاصل از بررسي اثر تيمارهاي مختلف كودي بر روي تعدادي از خصوصيات مورد بررسي گياه به‌ليمو به روش آزمون LSD…………………………..54
فهرست شکل‌هاعنوانصفحهشكل 1-1 نمايي از گياه به‎ليمو به همراه گل‌هاي سفيد……………………………………..5شکل 1-2 فرمول شيميايي برخي از مواد تشکيل دهنده‌ي اسانس به‌ليمو ……………………12شکل 3-1- تهيه‌ي و آماده‌سازي هورمون‌ها جهت اضافه کردن به محيط کشت‌هاي جامد و مايع…32شکل 3-2 کشت به‌ليمو در محيط‌هاي کشت مايع و جامد ………………………………34شکل 3-3- كشت به‌ليمو در شيشه‌هاي کشت ………………………………………..35شکل 3-4 زمان يادداشت‌برداري از ريزنمونه‎هاي رشد يافته به‌ليمو ……………………….36شکل 3-5 بستر آماده شده جهت کشت به‌ليمو پس از شخم زدن مزرعه ……………………37شکل 3-6 نمايي از کرت‎هاي مختلف به‎ليمو پس از استقرار در مزرعه ……………………38شکل 3-7 يادداشتبرداري صفات مورد مطالعه به‌ليمو در کرت‎هاي حاوي تيمارهاي مختلف کودي ………………………………………………………………………..38شکل 3-8 برداشت به‌ليمو به صورت شاخه بريده و برگ‌هاي خشک شده …………………39
چکيده
جنس Lippia داراي بيش از 200 گونه است كه در اين بين گونه Lippia citriodora L. داراي ارزش بالاي دارويي ميباشد. اين گياه به دليل اهميت فراوان اقتصادي در صنايع غذايي، داروسازي و عطرسازي در قسمت‌هاي مختلفي از ايران كشت و كار ميشود و گونههاي بومي نيز از جنس Lippia در مناطق گرمسيري و نيمهگرمسيري كشور وجود دارد. بدين منظور دو آزمايش جداگانه در شرايط درون شيشه‌اي و مزرعه‌اي انجام شد. در شرايط آزمايشگاهي سه آزمايش جداگانه با استفاده از طرح کاملا تصادفي با 4 تکرار انجام شد و در آن اثر 13 تيمار مختلف هورموني (BAP، NAA، 2,4-D و كينتين) و اثر زمان بر ميزان كالوس‌زايي و باززايي ريزنمونه‌هاي به‌ليمو بررسي گرديد. با توجه به نتايج تجزيه واريانس در آزمايش درون شيشه‌اي در غلظت‎هاي مختلف هورموني، صفت‎هاي ريشه‎زايي، ساقه‎زايي، کالوس‎زايي، تغييررنگ، تغييرشکل در سطح يك درصد معني‌دار شدند. در مقايسه‌ي ميانگين بين تيمارهاي مورد بررسي مشخص شد كه محيط کشت MS12 حاوي 3/0 ميلي‌گرم بر ليتر اكسين NAA بدون سيتوكنين براي صفت‌هاي ريشه‌زايي، كالوس‌زايي، زنده‌ماني، تغيير رنگ و تغييرشكل به‌ترتيب با 8/63، 6/91، 100، 2/97 و 2/92 درصد بهترين تيمار هورموني بود، ولي در مورد ساقه‌زايي، محيط كشت MS بدون هورمون با 3/68 درصد بيشترين تعداد نوساقه‌ها را ايجاد نمود. در آزمايش مزرعه‌اي نيز از بين چهار سطح كودي مختلف شامل صفر، 50 و 100 كيلوگرم در هكتار ازته و غلظت سه در هزار NPK بر روي صفات مورفولوژيكي و ميزان عملكرد گياه بهليمو، تيمار 50 كيلوگرم در هكتار كود ازته بهترين نتايج را در بر داشت.
کليد واژه: به‌ليمو، كالوس‌زايي، ساقه‌زايي، ريشه‌زايي، ترکيبات هورموني، کود ازته.
فصل اول
مقدمه و کليات
1-1 گياهان دارويي
1-1-1 اهميت كشت گياهان دارويي
با ظهور داروهاي شيميايي و بيولوژيك، نقش و اهميت گياهان دارويي در تأمين سلامت بشر، در معرض فراموشي قرار گرفت. اما با گذشت زمان، استقبال از گياهان دارويي با رشد قابل توجهي روبرو شده است. بهنظر ميرسد مردم جهان از يك سري نارساييهاي طب مدرن خسته شدهاند و به‌طور روز افزون به‌سمت داروهاي گياهي روي ميآورند. اصولاً زماني كه قانون ابنسينا را در غرب به آتش كشيدند و ادعا كردند شيمي، مولكول و فيزيولوژي را شناختهاند، طب به انحراف كشيده شد. بهطوري كه هماكنون طب مدرن توانايي حل بسياري از مشكلات بشر را ندارد و طي سالهاي اخير در كتب درسي به اين موضوع اعتراف كردهاند. بههمين دليل، امروزه حدود 50 درصد داروهاي توليد شده در جهان منشاء طبيعي دارند كه با تغييراتي بهعنوان دارو مورد استفاده قرار ميگيرند. كه نيمي از اين مقدار از منابع معدني، حيواني و باكتريايي بدست ميآيد و نيمي ديگر منشاء گياهي دارد. براي مثال، تمام هورمونهاي مصرفي گياهي هستند و از گياهان مختلفي نظير سيبزميني مكزيكي، شنبليله و غيره بهدست ميآيند. همچنين تركيباتي مثل وينبلاستين و وينكريستين كه از داروهاي ضدسرطان هستند از گياه بدست ميآيند و يا گليكوزيدهاي قلبي از جمله اين گروه داروها محسوب ميشوند (قاسمي دهكردي و همكاران، 1380).
گياهان دارويي يكي از مهم‌ترين منابع دارويي ميباشند كه از هزاران سال پيش كاربرد داشتهاند. سازمان بهداشت جهاني تخمين زده است كه بيش از 80 درصد از مردم بهصورت سنتي و يا مدرن از گياهان دارويي استفاده ميكنند. بعلاوه برخي از داروهاي شيميايي نيز با الگوبرداري از مواد گياهي ساخته شدهاند (تريپاتي1 و تريپاتي، 2003).
در قرن اخير دانشمندان به زيانهاي ناشي از سموم شيميايي، مواد افزودني، اسانس و طعمدهندههاي مصنوعي كاملاً پيبردهاند و بروز انواع سرطانها و بيماريهاي مختلف تأييدكننده اين موضوع ميباشند. بر اين اساس كشورهاي پيشرفته كه داراي امكانات تحقيقاتي گسترده‌اي در مورد شناسايي اين مواد مضر بوده‌اند، تصميم گرفتهاند كه در چند سال اخير كليهي مواد مصرفي شيميايي را از مواد غذايي، دارويي، آرايشي و بهداشتي بتدريج حذف نموده و بجاي آن از منابع گياهي استفاده كنند .كشور ما داراي غنيترين منابع گياهي از نظر مقدار و تنوع در سطح جهان ميباشد .هماكنون كشورهاي پيشرفته پي به ارزش گياهان دارويي و صنعتي برده و درصدد كشت و پرورش آنها در ساير كشورهاي فقير شدهاند. شناسايي گياهان اسانسدار گامي مهم در جهت اهلي كردن و ترويج شيوههاي صحيح بهرهبرداري و استفاده از اين گياهان مي‎باشد. گياهان دارويي اسانسدار نقش مهمي در زندگي انسان دارند و در ايران از سابقه طولاني برخوردار ميباشند (موسويان و بصيري، 1378).
در گذشته گياهان دارويي جمعآوري شده از طبيعت براي رفع نيازهاي بازار كافي بود، طي ساليان گذشته تعدادي از گونههاي پرمصرف در خطر انقراض قرار گرفتهاند، براي رفع نيازهاي فزاينده به داروهاي گياهي، گياهان بايستي كشت شوند، علاوه بر اطمينان از منابع كافي كشت گياهان دارويي باعث توليد مواد خام دارويي با كيفيت يكنواخت و خصوصيات شناخته شده ميگردد. از سوي ديگر تامين مواد اوليه براي صنايع داروسازي نياز به افزايش توليد محصول در واحد سطح دارد كه علميترين و اقتصاديترين روش دستيابي بهاين مهم افزايش كارايي نهادههاي مورد استفاده در زراعت گياهان دارويي ميباشد (توماس2، 2000).
كشت يك گياه دارويي از نظر اقتصادي وقتي مقرون بهصرفه است كه متابوليتهاي ثانويه آن بهحد مطلوب رسيده باشد، با شناخت عوامل محيطي موثر در توليد و انتخاب ارقام گياهي مناسب ميتوان بهحد اكثر مقدار محصول دست يافت (اميدبيگي، 1386). در مناطقي مثل ايران وجود نور فراوان يكي از منابع مهم و بالقوه در توليد گياهان دارويي است كه بايد يا مناسبترين روشها از آن استفاده كرد (اميدبيگي، 1386). در شرايطي كه هيچگونه محدوديت عوامل محيطي وجود نداشته باشد، توليد ماده خشك گياهي با مقدار نور جذب شده متناسب است (مونتيس3، 1994).

1-1-2 تاريخچه گياهان دارويي
با نظري اجمالي به فرهنگ مصرف داروهاي گياهي در ايران ميتوان متوجه ميراث با ارزش اين گياهان در طب غني سنتي ايران شد. از طرفي فلات وسيع ايران از اقليمها و محيطهاي گوناگون برخوردار است، بههمين دليل بيش از 7500 گونه گياهي مختص به ايران است. از اين رو بهحق، فلور ايران يكي از منابع داروخيز جهان محسوب ميشود. از آنجايي كه گياهان وحشي در محدودههاي جغرافيايي گستردهاي يافت ميشود، جمعآوري و دسترسي به آنها از نظر اقتصادي مقرون بهصرف نيست و استفاده از گياهان وحشي جوابگوي صنايع داروسازي نخواهد بود و چنين استفادهي انبوه از گياهان طبيعت مسلماً موجب نابودي آنها خواهد شد. از اين رو نسبت به كشت اين گياهان در سطوح زراعي اقدامات مفيدي در سطح كشور انجام شده است. گزارش شده است كه انسان دير و يا زود چارهاي بهجز بازگشت به طبيعت خود نخواهد داشت. از اين رو، در كشورهاي توسعه يافته اقدامات وسيعي را در توسعه و پيشرفت كشت و استفاده از گياهان دارويي انجام شده است. اميد است در كشور ما با تربيت نيروي متخصص و فرهنگسازي استفاده از گياهان دارويي، از اين نعمت الهي بينصيب نمانيم (ابراهيمپور و عيديزاده، 1388).
ابنسينا، دانشمند و پزشك نامدار ايراني در سالهاي 428-370 هجري مطابق با 980-1037 ميلادي كه در غرب او را بهنام آويسينيا مي‌شناسد و پس از انقراض تمدن يونان او را بزرگ‌ترين دانشمند جهان و به اشتباه، عرب دانستهاند (چون كتابهاي او به عربي نوشته شده است). در جلد دوم كتاب قانون فيالطب بيش از 800 نمونه گياه طبي و غذايي را نام ميبرد كه از آن ميان 541 گياه و مشتقات آنها داراي توصيف كاربردي و صفات ريختشناختي هستند. او اختلاف شكل و صفات گياهان مشابه يا نزديك به هم را (براي اجتناب اشتباه آنها از يكديگر) با توجه خاصي در كتاب “قانون” توضيح ميدهد و در مورد چگونگي استفاده از مشتقات گياهان دارويي و كاربرد آنها، با ترتيبي خاص، معين و نظام يافته به شرح و تفصيل آنها ميپردازد (زارعزاده، 1383).
آلبرت ماگنيوس4 اين كشيش كه در نوشته‌ها به آلبرت بوستادت بيشتر معروف است، در سال‌هاي 1193-1280، بعد از ابنسينا و بيروني در ايام و بحران فكري قرون وسطي اروپا، درباره طب و تاريخ طبيعي و همچنين گياهشناسي كتابي به نام رستنيها، دو وژتابليس5 را نوشت. محتويات و نحوه نگارش اين كتاب، به خوبي نشان ميدهد كه آلبرت كبير نيز تحت تأثير شديد تئوفراست و ديگر دانشمندان و قدماي رم و يونان مورد قبول كليسا قرار داشت و در عين حال، برخي مشاهدات خود را نيز در اين كتاب آورده است (زارعزاده، 1383).
ايرانيان از ديرباز و حتي پيش از ديگران در زمينه گياهان دارويي و كاربرد درماني آنها از دانش پيشرفته‌اي برخوردار بودهاند. نمونه بارز آن كتاب باستاني اوستاست .در”ونديداد” يكي از پنج كتاب تشكيلدهنده اوستا (كه در مجموع دستكم 2500 سال پيشينه دارد)، بخشهاي پرشماري به گياه درماني، معرفي گياهان دارويي و كاربرد آنها اختصاص يافته است. اما متأسفانه در لشكركشي اسكندر مقدوني، كتابخانه مشهور اسكندريه در آتشسوزي عمدتاً نابود شد و بيشتر منابع و آثار و كتابهاي جمعآوري شده در آن سوخت و خاكستر شد. بدين ترتيب، سوابق گياهشناسي شرق كهن در دو تمدن ايران و مصر بر اثر اين آتشسوزيها، فاقد هر گونه مدرك ديرينه شناخت گياهان دارويي و خواص آنها گرديد. متأسفانه بعدها نيز بر اثر تخريب قلاع فرقه اسماعيليه و آتش زدن كتابخانههاي آن بوسيله هلاكوخان مغول، بقيه آثار مكتوب گياهان دارويي، كه توسط اين فرقه جمعآوري شده بود، از ميان رفت، تا اينكه در قرن هشتم و نهم ميلادي، اطباء ايراني رونق خاصي به طبابت ايران و جهان بخشيدند. بطوريكه با پيدا شدن دانشمندان و نوابغي نظير ابوعليسينا و محمد زكرياي رازي با انشار كتابهاي معروف خود (قانون و الحاوي) پيشرفتهاي زيادي نصيب ملت ايران و جهانيان گرديد. اين پيشرفتها همچنين در قرون بعد نيز ادامه يافت. در قرن 13 ميلادي، ابنبيطار، اختصاصات متجاوز از 1400 گياه را كه خود شخصاً ميشناخت را در كتابش شرح داد (دوازده امامي، 1386؛ زارعزاده، 1383).
1-2 به ليمو
1-2-1 تاريخچه و معرفي بهليمو
گياه بهليمو (شکل 1-1) با نام علمي Lippia citriodoraاز خانواده شاهپسند (Verbenaceae) (مظفريان، 1389؛ زرگري، 1375)، اين گياه بومي آمريکاي جنوبي است (زرگري، 1375) و بهنام پزشک گياهشناسي موسوم به Lippi که در سالهاي 1678 تا 1704 ميلادي ميزيسته و در حبشه بهقتل رسيد، نامگذاري شده است (زرگري، 1375). در فرهنگ گياهدرماني ايران، برگهاي اين گياه بهصورت دمکردني بهمنظور آرامبخش، ضدتشنج و برطرفکننده تپش قلب و سرگيجه مصرف دارد (امين، 1388). تا 100 سال پيش فقط بهعنوان يك گونه زينتي شناخته ميشد، ولي امروزه بهدليل اهميت فراوان اقتصادي آن در صنايع غذايي و عطرسازي در اكثر كشورها از جمله در ايران و به ويژه در استان گلستان كشت شده و به خوبي پرورش مييابد. امروزه اين گياه در شمال كشورمان كشت و كار ميشود و گونههاي بومي آن از جنس Lippia در مناطق گرمسيري و نيمه‌گرمسيري كشورمان وجود دارد (امين، 1370).
شكل 1-1: نمايي از گياه به‎ليمو به همراه گل‌هاي سفيد
1-2-2 بهليمو (Lemon verbena) از نظر ردهبندي گياهي
به‌ليمو از سلسلهي Planta، شاخهي Magnoliophyta، ردهي Magnoliopsida، راستهي Lamiales، خانواده Verbenaceae، جنس Aloysia، و گونهي A. triphylla، است(آنونيموس6، 2007).
1-2-3 گياهشناسي بهليمو
بهليمو درختچهاي کوچک به ارتفاع تا 90-100 سانتيمتر، با شاخههاي شياردار و کم و بيش زبر برگها در چرخههاي 3 يا 4 تايي، سرنيزهاي، بهطول 5- 5/7 سانتيمتر، با دمبرگ کوتاه، کامل يا در ميانه دندانهدار، بدون کرک، در سطح تحتاني بهانبوهي پوشيده از کرکهاي غدهدار (منقوط)، با بوي ليمو سنبلهها چرخهاي و محوري يا مجتمع شده در پانيکولهاي انتهايي اغلب 3 تايي. گلها سفيد، به طول 5/4- 5 ميليمتر، شکوفا و گلدهنده در تابستان و پاييز. کاسه گل به انبوهي کرکدار. لوله جام گل بلندتر از کاسه (زرگري، 1375).
1-2-4 نامهاي ديگر بهليمو
براي به‌ليمو نام‌هاي ديگري نيز در منابع ذكر شده است كه به تعدادي از آن‌ها اشاره مي‌شود.
Lippia citriodora Kunth (آزادبخت، 1378؛ زرگري، 1371؛ كريمي، 1381؛ يزداني و همكاران، 1383) Lippia citriodora H.B.U.K (راشدي، 1380؛ كريمي، 1381)
Lippia triphylla (راشدي، 1380؛ صمصام شريعت، 1374)
Verbena triphylla L Herit (رضايي و همكاران، 1380؛ يزداني و همكاران، 1383)
Aloysia citriodora orteg (رضايي و همكاران، 1380؛ يزداني و همكاران، 1383)
Aloysia triphylla (L “Herit) Britton (راشدي، 1380)
1-2-5 گونه‌هاي ديگر به‌ليمو
گونههاي مفيد ديگري از اين گياه وجود دارد و در محلهاي رويش، كاربرد درماني دارند كه در زير به طور گذرا به آنها پرداخته شده است:
1-Lippia graveolens H.B.& K : در برزيل و مكزيك ميرويد .تيزان حاصل از آن براي درمان روماتيسم بهكار ميرود.
2-:scaberrima L. Sond در آفريقاي جنوبي ميرويد و بهعنوان بندآورنده و منعقدكننده خون، مصرف مي‌گردد.
3- Cham microcephala L.: درختچهاي است بومي برزيل كه برگهايي پوشيده از تارهاي غدهاي مملو از اسانس مطبوع و گلهايي سفيدرنگ دارد .بوي آن شبيه بوي آويشن و رومارن است .از آن بهمنظور رفع تشنج و درمان ناراحتيهاي ناشي از گزش مار استفاده ميشود.
4- : geminata L. (Willd citrata L.) درختچهاي است بومي جزاير آنتيل و نواحي مختلف آمريكاي جنوبي كه معادل 123/0 درصد اسانس پك اولت (peck olt) از آن بهدست ميآيد .برگ اين گياه بهصورت دمكرده و در رفع نزله بهكار ميرود.
5- Hochst adoensis L.: در آمريكا مي‌رويد و از برگ آن براي رفع تب و سرفه استفاده مي‌شود. داراي اندامهاي معطر و اسانسي با تركيب شيميايي متفاوت برحسب منشأ جغرافيايي است (در محل اصلي رويش، براي آن 4 گونه قائلاند). سرشاخهي گلدار اين گياه بيشتر از سرشاخههاي برگدار آن، اسانس دارد. گلهاي آن معادل 14 تا 15 در هزار اسانس خام با بوي معطر توليد ميكند كه معادل 37 درصد كامفر چپ از آن استخراج ميشود.
6- :Lantana pseudo- theaSt. Hill L.pseudo- Thea درختچهاي است بومي نواحي گرم آمريكا كه بيشتر در مناطق مرتفع برزيل ميرويد. داراي برگهاي متقابل با بوي مطبوع بسيار قوي است. بوميان محل از آن دمكردهاي تهيه ميكنند كه براى رفع تشنج كاربرد دارد (رضايي و همكاران، 1380).
1-2-6 منشأ و پراکنش بهليمو در ايران
بهليمو بيشتر در زمينهاي آفتابگير، با خاك داراي نفوذپذيري (خاك لومي سبك) و رطوبت و آب كافي، رشد مينمايد (زرگري، 1371). اين گياه در برابر سرما و وزش باد شديد حساس است (راشدي، 1380). اين گياه را ميتوان در نواحي مديترانهاي كاشت مانند بخش اعظم كرمانشاه بهجز ناحيهاي محدود در جنوب غربي مانند پاوه، مريوان، اسلام آباد غرب، جوانرود، سرپل ذهاب، قصرشيرين، استان ايلام: گيلان غرب استان لرستان: خرم آباد و جنوب غربي آن، كوهدشت، شمال شرقي خوزستان: ايذه، شمال شرقي، كهكيلويه و بويراحمد: ياسوج، سي سخت، شمال غربي استان فارس: نورآباد ممسني، آباده، بخش اعظم چهارمحال و بختياري: شهركرد، لردگان، فارسان و جنوب غربي چهارمحال و بختياري، استان اصفهان: سميرم، شهرضا و فريدون شهر، ناحيه معتدل بخش اعظم استان مازندران، رامسر، نوشهر، ساري، نور، بهشهر، ناحيهاي محدود در شرق استان گيلان (چابكسر) (مظفريان، 1383).
1-2-7 اهميت اقتصادي بهليمو
گياهان دارويي يكي از منابع غني كشور بوده كه امكان صادرات آن نيز وجود دارد، زيرا وقتي به ارقام واردات كشورهاي اروپايي مثل آلمان و فرانسه توجه نمود، معلوم ميگردد كه گياهان دارويي بازار بزرگي در جهان داشته و كشور ما ميتواند به يكي از مهمترين صادركنندگان اين گياهان تبديل شود. بهليمو برگهاي سبز و روشن با بوي مشابه ليمو دارد (كارنات7، 1999). اسانس آن بوي بسيار مطبوع دارد و در تهيه اودوکلن مورد استفاده قرار ميگيرد (زرگري، 1375). ضماد له کردهي تازهي آن براي التيام زخم مفيد است (حاجيشرفي، 1388). در تجارت گياه براي توليد اسانس توليد ميشود (مظفريان، 1391). باتوجه به بازدهي بالاي بهليمو در سطح و قيمت بالاي برگ خشك اين گياه و اينكه تقاضاي بهليمو در كارخانجات و مصارف عطاري‌هاي در سالهاي اخير بيشتر شده از اينرو توليد و بهرهبرداري از آن در مزارع كشور توجيه اقتصادي دارد.
1-2-8 روش پرورش گياه بهليمو
تكثير بهليمو، به شيوهي قلمهزدن شاخهها، خوابانيدن آنها (راشدي، 1380؛ رضايي و همكاران، 1380؛ زرگري، 1371) يا به وسيلهي پاجوش (راشدي، 1380؛ رضايي و همكاران، 1380) در زمينهاي زراعي نفوذپذير و مرطوب صورت ميگيرد. بهدليل حساس بودن اين گياه در برابر افزايش دما، آبياري زمين زراعي در فصلهاي گرم سال، امري الزامي است (زرگري، 1371؛ گرونوالد8، 2004). البته با استفاده از اين روش، تعداد محدودي گياه با توجه به حجم خزانه در دسترس و همچنين تعداد پايههاي مادري اوليه توليد ميشود (اميدبيگي، 1376).
تكثير به وسيلهي قلمه زدن بدين صورت انجام ميگيرد كه شاخههاي جوان گياه را كه در آغاز، رويش طولي دارند از ساقه قطع ميكنند و پس از جدا نمودن برگها، اين قلمههاي خشبي را در بستر يا نهالستان‌هايي كه زمين آن، از قبل آماده گرديده است، كاشته ميشوند. با آبياري مرتب قطعه زمين نهالستان آماده مي‌گردد، قلمهها به تدريج در پاييز ريشهدار ميشوند و بر اثر رشد و نمو، آمادگي انتقال به زمين زراعي را پيدا ميكنند. دور آبياري هر 5-10 روز يك بار بسته به بافت خاك و اقليم منطقه متفاوت است. زمين زراعي را بايد از قبل به عمق 40 تا 50 سانتيمتر بهخوبي شخم زده و تهيه كرده باشند، در غير اين صورت ريشههاي گياه، نمي‌توانند بهآساني در داخل خاك نفوذ نمايند و رطوبت لازم را بهدست آورند و در خاك استقرار يابند. بر پايه برخي توصيههاي كارشناسي ديگر بايد زمين محل كشت، را در دو نوبت ديگر شخم زد (آخرين نوبت بهمنظور اضافه و مخلوط كردن انواع كودها، بهدرون خاك). پس از انجام اين كارها در سطح زمين زراعي، خطوطي بهفاصلهي يك متر ايجاد و سپس فواصلي بهطول 60 سانتيمتر در آن مشخص مينمايند كه هر يك از نقاط ياد شده محل انتقال يكي از قلمههاي ريشهدار گياه است. پيش از انتقال قلمههاي ريشهدار بهزمين زراعي، آنها را از ناحيهي يك سانتيمتري يقه، قطع ميكنند و ريشههاي دراز شده گياه را نيز كوتاه مينمايند (هرس ريشه يا هابياژ) تا با اين عمل ريشههاي جانبي، سريعتر آمادگي رويش پيدا نمايند. عمل انتقال قلمهها بايد بهخوبي همراه با ضدعفوني قلمهها با يكي از قارچكشهاي مناسب و زير نظر كارشناسان گياهپزشكي يا حفظ نباتات بهوسيله دست صورت گيرد. پس از انجام ضدعفوني و انتقال قلمهها بهداخل خاك، بايد قسمتي از خاك اطراف آنها بر اثر فشار انگشتان بر روي گياه ريشهدار و عاري از ساقه، بهحالت فشرده درآيد تا علاوه بر خروج هواي اضافي (هواگيري) قلمهها بتوانند بهخوبي استقرار يابند. در پاييز پس از انجام مراقبت‌هاي لازم براي نگهداري گياه از عوامل نامساعد محيط خارج، سطح زمين را با قشري از برگهاي خشك مي‌پوشانند و سپس در بهار آنها را از روي قلمهها خارج ميسازند. تمام عمليات مناسب باغباني مانند كوددهي بهموقع بايد پس از آزمون خاك و زير نظر كارشناسان تغذيه و باغباني براي هر هكتار زمين زراعي، حدود 200 كيلوگرم كود ازته نيترات سديم، مقدار 300 كيلوگرم سوپر فسفات و ميزان 100 كيلوگرم كود سولفات پتاسيم بهدقت اعمال گردد. پس از جمعآوري محصول، شاخههاي برگدار گياه را قطع و سپس آنها را بهطور طبيعي بهصورت دستهاي و بهوضع آويزان در انبارهاي ويژهاي نگهداري ميكنند، بهنحوي كه جريان هوا در آن محل بهخوبي برقرار باشد. پس از خشك شدن، برگها را از شاخهها جدا و در گونيهاي كنفي يا پارچهاي 50 تا 70 كيلوگرمي بستهبندي و روانه بازار تجارت مينمايند (زرگري، 1371). حدود 1700 قلمه با فواصل 12-80 × 50-40 سانتيمتر در هكتار ميتوان كاشت. pH بهينه مورد نياز محدوده 7 (يعني تقريباً خاك قليايي يا خنثي) است (مظفريان، 1383).
1-2-9 زمان جمعآوري بهليمو
زمان جمعآوري و چيدن برگها اواخر تابستان است (كريمي، 1381) و 2 تا 3 نوبت در سال و كار چيدن برگها بسته به شرايط اقليمي و وضعيت رشدي گياه بهطور معمول همزمان با ماههاي خرداد، مرداد و مهر است (راشدي، 1380؛ زرگري، 1371؛ يزداني و همكاران، 1383). برداشت بهصورت هرس شاخههاي گياه صورت ميپذيرد. بايد تا حد امكان از شكسته شدن برگها طي عمليات برداشت و خشك كردن جلوگيري شود. ميانگين عملكرد آن 1200 كيلوگرم در هكتار برگ خشك (ميزان اسانس در برگ خشك 2/1 تا 81/0 درصد) است (مظفريان، 1383).
1-2-10 خواص دارويي و كاربردهاي بهليمو
تببر، ضداسپاسم، ضدخستگي بدن، آرامبخش و آرامکنندهي اعصاب است، براي تقويت معده، رفع درد شکم، دلپيچه و کاهش نفخ موثر است، برا رفع تپش قلب، تسکين ميگرن، رفع سرگيجه و صداهاي داخل گوش مفيد ميباشد (حاجيشرفي، 1388). بهليمو خاصيت مسکن ملايم و شهرتي براي آرام کردن ناراحتي‌هاي شکمي دارد. اثر مقوي آن روي سيستم عصبي با قطعيتي کمتر از فرنجمشک است، با وجود اين به شادابي کمک ميکند و برعليه افسردگي موثر است (مظفريان، 1391). از نظر تقويت معده، بايد آنرا در رديف بهترين داروها قرار داد و براي اينمنظور نيز بهتر است هميشه بهصورت دم کرده مانند چاي مصرف شود (زرگري، 1375).
تركيب ليمونن مادهي تلخ مركبات و ليمو و داراي اثر سمي و تحريككننده پوست است. ليمونن در فرمول فرآوردههاي دارويي مانند قرص بيكربنات سديم و پمادهاي ضدعفونيكننده وارد، همچنين در ساخت ويتامين A از آن استفاده ميشود. تركيب ليمونن در صنايع عطرسازي، بهمنظور معطر نمودن مواد آرايشي، ساخت صابونهاي رنگي، خوشبوكنندهها، طعمدهندهها، بهعنوان حلال در ساخت رزينها و مرطوب كننده بهكار ميرود (راشدي، 1380).
تركيب 1و 8- سينوئل داراي اثرات كرمكشي، ضدآلرژي، گندزدايي، قارچكشي، باكتريكشي، تسكين‌دهنده، خلطآور، پايينآورندهي فشار خون، جلوگيري از التهاب گلو، التهاب حنجره، تحريك سيستم مركزي اعصاب و توليد صفرا بهوسيلهي كبد و در مواردي سبب قرمز شدن پوست و آلرژيزا است. تركيب ليمونن نيز يك مونوترپن تك حلقهاي با جرم ملكولي 136 بهشكلهاي راست گرد، چپگرد و شكل راسميك و مايعي بيرنگ با بويي شبيه ليمو و در آب غيرقابل حل، ولي در الكل قابل حل است. در مجاورت هوا، يك لايهي اكسيد تشكيل ميدهد و اين لايه رفتاري همانند لاستيك يا روغنهاي خشكشونده دارد (راشدي، 1380). همچنين بهعنوان ادويه در مصارف خانگي براي خوشبو و معطر ساختن گوشت، ماهي، انواع مربا، پوره و غيره بهكار ميرود. اسانس بهليمو، داراي خواص باكتريكشي و حشرهكشي است (كريمي، 1381).

1-2-11 مواد تشكيلدهنده اسانس بهليمو
متابوليتهاي ثانويه، مواد آلي شيميايي پيچيدهاي هستند كه گياهان در طول حيات خود توليد مينمايند، ولي در رشد و نمو و فعاليتهاي حياتي آنها نقشي ندارند و عمدتا بهمنظور دفع آفات، جذب حشرات گردهافشان و مبارزه با بيماريهاي ميكروبي در گياه توليد ميشوند (كومار و گوپتا9، 2008). در ايران ميزان اسانس برگ گياه بهليمو 6/0 درصد است. و بهنحو عمده شامل 24 ماده مختلف ميباشد، ليمونن10 (29.4%) و 1 و 8- سينئول11 تركيبهاي اصلي ميباشند. ژرانيول12، مگاژرانيول13 و كارمنفنيلاكسيد 14از ساير تركيبهاي اصلي اسانس ميباشند (مجاب، 1381؛ سارتوراتو15، 2004).
مجاب و همكاران (2003)، ترکيبات اسانس برگهاي بهليموي تهيه شده از عطاري تهران را ژرانيول، نرول، نرال، ژرانيال، ليمونن و 1 و 8- سينئول، اسپاتولنول16 و آلفاکورکومن17 گزارش کردند. طي پژوهشي عمده‌ترين ترکيبات اسانس در برگ بهليمو ليمونن، 1 و 8- سينئول، ژرانيال، نرال18، بتا-گوانين19، اسپاتولنول و سايوفيلناکسيد گزارش شده است (رضايي و جايمند، 2002).
با توجه بهاينکه مهمترين ترکيبات مورد استفاده از اسانس گياه بهليمو در صنايع مختلف خصوصاً صنايع دارويي، ژرانيال و نرال ميباشد و ميزان اين ترکيبات بهطور مشخص و فرايندهاي در اسانس استحصالي از بذر اين گياه در مقايسه با ساير اندامها در گزارشهاي يادشده بيشتر است، بنابراين توصيه مي‌شود که با اعمال روشهاي اصلاحي و بهزراعي متعدد که منجر به افزايش توليد بذر و افزايش کمي و کيفي اسانس آن ميگردد، منابع گياهي ترکيبات مذکور را افزايش داد (شاهحسيني و همكاران، 1390).
1-2-12 فرمولهاي شيميايي و شكل نمايي از برخي مواد تشكيل دهندهي اسانس بهليمو
در اسانس حاصل از گياه به‌ليمو مواد مؤثره فراواني وجود دارد (شکل 1-2) از قبيل ژرانيول با فرمول شيميايي C10H18O، ليمونن كه يكي از اصلي‌ترين مواد مي‌باشد با فرمول شيميايي C10H16 که يک مايع بي‌رنگ هيدروکربني از کلاس سيکلوترپن است و معمولاً ايزومر D آن بوي قوي‌اي مانند پرتقال دارد. در سنتزهاي شيميايي به‌عنوان پيش ماده‌اي براي Carvone و نيز به‌عنوان يک حلال تجديدپذير در شوينده‌ها بکار مي‌روند. همچنين لينالول و نرول نيز با فرمول شيميايي C10H18O به‌همراه بسياري تركيبات ديگر وجود.

ژرانيول ليمونن
نرول لينالول
شکل 1-2 فرمول شيميايي برخي از مواد تشکيل دهنده‌ي اسانس بهليمو
1-3 كشت بافت
روش‌هاي كشت بافت گياهي و بخصوص زمينه تجاري آن كه ريزازديادي ناميده مي‌شود، از فناوري‌هاي كاربردي با دورنمايي جديد جهت تكثير رويشي گياهان مي‌باشند كه امكان توليد گياهاني سالم با ژنوتبپ يكسان را فراهم مي‌نمايند. روش ريزازديادي ضريب تكثير بالايي دارد، روند سلكسيون را كوتاه ميكند و عمليات آن با اقتصادي نمودن مكان‌هاي مورد نياز جهت كشت گياهان در تمام طول سال قابل انجام است. در بسياري از كشورهاي دنيا، ريزازديادي گياهان كه از آن تحت عنوان يك صنعت زيستي نام برده مي‌شود، در مسير صنعتي شدن قرار گرفته است و تاكنون صدها شركت كاري فعال در اين زمينه معرفي گرديده‌اند (قاسمي بزدي و رمضاني مقدم، 1391).
يكي از مزاياي روش‌هاي ريزازديادي، سرعت تكثير بسيار بالاي گياهان براساس انتقال ماهيانه ريزنمونه‌ها به محيط كشت‌هاي جديد مي‌باشد و تعداد گياهان توليد شده از هر ريزنمونه را مي‌توان در هر سال براساس سرعت‌هاي تكثيري مختلف و واكشت‌هاي ماهيانه در شرايط در شرايط متفاوت كشت و براي گونه‌هاي مختلف، پيش‌بيني نمود. به‌طور مثال با ضريب تكثير دو گياه در ماه، طي يك سال مي‌توان حدود 4 هزار گياه از هر ريزنمونه به‌دست آورد. با افزايش ضريب تكثير به 3 و 4 گياه در ماه، طي يك سال مي‌توان به‌ترتيب به بيش از 500 هزار و 16 ميليون گياه از هر ريزنمونه رسيد (قاسمي بزدي و رمضاني مقدم، 1391).
اين فن‌آوري در آغاز قرن بيستم از تفکر دانشمند آلماني بهنام هابرلند با توجه به خاصيت توتي‌پتنسي سلول منشا گرفت. هابرلند پيشنهاد کرد که بايستي تکنيک‌ها و روش‌هايي براي جداسازي و کشت‌بافت‌هاي گياهي با اين فرض شکل گيرد که اگر محيط و مواد غذايي سلول‌هاي کشت شده بهدرستي کنترل شوند آن سلول‎‌ها به گياهي طبيعي تبديل خواهند شد (باقري و صفاري 1386؛ قاسميبزدي و رمضانيمقدم، 1391). در سال 1934 اولين کشت بافت موفق توسط وايت انجام شد و اولين کشت کالوس موفق هويج و توتون تا سال 1939 توسط وايت گزارش شد (قاسمي بزدي و رمضاني مقدم، 1391).
مفهوم اصلي کشت بافت آن است که کليه عوامل ضروري لازم براي يک بافت (آنهايي که توسط خود بافت کشت شده تامين نمي‌شود) در يک محيط کشت مصنوعي فراهم آيد. از نخستين مواد مهم 16 عنصر ضروري را مي‌توان نام برد. کربن، هيدروژن و اکسيژن با يک قند و معمولاً با گلوکز يا ساکارز تامين مي‌شوند، در حالي که موادغذايي عمده يا پرمصرف (Ca,K,Mg,N,P,S) و مواد‌غذايي کم‌مصرف (Mn,Mo,Zn,B,Cu,Fe) به‌صورت نمک‌هاي معدني تامين مي‌گردند. همغلظت و همتوازن عناصر غذايي براي رشد مناسب بافت در محيط کشت اهميت دارند. دستورالعمل متعلق به محيط موراشيگ و اسکوگ (MS) است. بيشتر بافت‌هاي کشت شده نيازمند يک يا چند ويتامين مثل تيامين، پيريدوکسين و نيکوتينيک‌اسيد هستند. مواد گوناگون ديگري نيز براي پاسخ‌گويي به نيازهاي بافت کشت شده و يا اهداف خاص محقق به محيط‌کشت افزوده مي‌گردد. هورمون‌هاي گياهي (اکسين‌ها، سيتوکينين‌ها، جيبرلين‌ها) اغلب مورد استفاده قرار مي‌گيرند. معمولاً آگار- آگار يا يک ماده جامد‌کننده مفيد ديگر جهت جامدسازي محيط براي حفاظت از گياه استفاده مي‌شود اگرچه در سال‌هاي اخير کشت بافت در محيط کشت مايع نيز شايع شده است (توحيد‌فر و کاوياني، 1389).
کشت درون شيشه‌اي ميتواند بافت يا اندام‌هاي کامل را در برگيرد و از اين رو نيازمند آن است که ساختار بافت واردشونده به محيط حفظ شود و يا مي‌تواند کشت سلول‌ها با تکثير سازمان نيافته را شامل شود. هدف گزينه‌ي اول معمولاً القاء ساختار تا رسيدن به گياه کامل است. مثال‌هاي برجسته‌ي اندام‌هاي گياهي معمولاً با دو هدف عمده انجام مي‌شود. هدف اول تحقيق پايه‌اي در جهت درک مکانيسم نمو (مثل جنين‌زايي يا نمو رشته‌هاي آوندي) از طريق کنترل محيط مي‌باشد. هدف دوم، بدست آوردن گياهان به گونه‌اي است که با روش‌هاي معمول امکان‌پذير نيست (مثل تلاقي‌هاي دور يا تکثير کلوني مريستم‌ها). ساير اهداف از طريق کشت تک‌سلول‌ها يا مجموع سلول‌ها برآورده مي‌شود. يک مجموع سلولي تمايزنيافته روي يک محيط‌کشت (نه غوطهور شده) کالوس ناميده مي‌شود (توحيد‌فر و کاوياني، 1389).

1-3-1 کشت کالوس
در کشت ‌بافت‌هاي گياهي، در اکثر موارد بافت کالوس توليد مي‌شود و ‌بافت‌هاي غده‌اي بندرت ديده مي‌شوند. کالوس يک بافت سازمان ‌نيافته و در حال تقسيم مي‌باشد که از سلول‌هاي تمايز ‌نيافته‌اي تشکيل شده است. در مراحل بعدي، اين سلول‌ها اختصاصي گرديده به‌طوري که به کالوس‌هايي تبديل مي‌شوند که از آنها تيپ‌هاي خاصي متمايز مي‌شوند. کالوس مي‌تواند هم بر روي قطعات بافت‌هاي مجزا (ريزنمونه‌ها) در شرايط درون ‌شيشه‌اي و هم بر روي گياهان در محل زخم‌هاي حاصل از برش توليد شود. تشکيل و تکثير درون شيشه‌اي کالوس با حضور هورمون‌هاي اکسين و سيتوکينين که تقسيم و طويل شدن سلول را تقويت مي‌کنند، افزايش مي‌يابد (رنجبر، 1384؛ فروتن و واديدار، 1385).
بافت کالوس در شرايط درون ‌شيشه‌اي معمولا سفيد يا زرد و گاهي‌ اوقات به رنگ سبز روشن مي‌باشد. رنگدانه قهوه‌اي تيره اغلب به خاطر پيري سلول‌هاي کالوس بروز مي‌کند و مربوط به تجمع فنل در آنها است. معمولا بافت کالوس حالت بي‌شکل دارد و نمي‌تواند ساختار آناتوميکي مشخصي داشته باشد، ولي بسته به منشا پيدايش و شرايط کشت ممکن است از نظر استحکام، ساختارهاي متفاوتي بهخود بگيرد (سلمر20 و همکاران، 1996).
شرط ضروري تمايززدايي سلول‌هاي گياهي و تبديل آنها به بافت کالوس،



قیمت: تومان


پاسخ دهید